2.3 UPLC-DAD-BChE在線分析方法

2.3.1 UPLC色譜條件

色譜柱Xtimate UPLC C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL；流速：0.08 mL·min-1；流動相:甲醇(B)-0. 1%甲酸水溶液(A)。

吳茱萸色譜條件：檢測波長330 nm；梯度洗脫:0～5 min，10%B；5～50 min，10%～45%B；50～70 min，45%～95%B；70～85 min，95%B。

鉤藤色譜條件：檢測波長 245 nm；梯度洗脫:0～10 min，10%～30%B；30～70 min，30%～45%B；70～90 min，45%～95%B；90～100 min，95%B。

苦參和山豆根色譜條件：檢測波長225 nm；梯度洗脫:0～5 min，5%B；10～40 min，5%～50%B；40～80 min，50%～95%B；80～90 min，95%B。

蓮心堿色譜條件：檢測波長：290 nm；流動相：甲醇（B）-0.1%甲酸溶液（A）（20:80）。

UPLC流速：0.08 mL·min-1；柱后BChE、DTNB混合溶液和BTCI流速分別為0.30 mL·min-1和0.10 mL·min-1。

2.3.2 UPLC-DAD-BCD在線聯(lián)用儀器系統(tǒng)

UPLC-DAD-BCD聯(lián)用儀器裝置見圖1。溶液流路采用三通管和相同內(nèi)徑的PEEK管連接。柱后衍生儀泵一為酶和DTNB混合溶液，泵二BTCI溶液。提取物經(jīng)過UPLC色譜柱分離后，在PDA檢測器顯示指紋圖譜，再與柱后衍生儀中的溶液反應，經(jīng) DAD檢測器檢測得到活性圖譜，酶+DTNB、BTCI溶液流速分別為0.30和0.10 mL·min-1，反應管0.5 mL，在405 nm檢測酶抑制活性圖譜。其反應原理如下：當柱后衍生儀以恒定的流速運輸BChE與DTNB混合溶液和BTCI溶液，3種溶液在反應管中連續(xù)反應，生成的5-thio-2-nitrobenzoate為黃色產(chǎn)物，可在405 nm處檢測得到平穩(wěn)基線。當UPLC分離出活性物質進入BChE反應體系，黃色產(chǎn)物量降低，同時在DAD檢測器上面就會呈現(xiàn)倒峰，從而實現(xiàn)BChE抑制劑的在線檢測。

2.4 UHPLC-LTQ/Orbitrap MS方法

UHPLC分析條件同“2.4.1”，流速為0.2 mL·min-1。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI）正離子模式；鞘氣（N2）和輔助氣（Ar）流速分別為40和10 arb. unit；毛細管溫度320 ℃；離子源電壓3.5 kV，電流100 μA；一級質譜質量掃描范圍為100～1 000 m/z，分辨率為60 000；二級質譜采用HCD模式，依賴一級質譜掃描中的1th到5th強峰，分辨率15 000；HCD裂解能量35 V。

3 結果與討論

3.1 UPLC-DAD-BChE在線分析方法的考察

流動相中的甲醇和乙腈能降低酶的活性，采用HPLC建立在線檢測方法需通過柱后分流降低流動相在酶反應體系的比例，減少對酶活性的影響，此在線聯(lián)用方式會產(chǎn)生儀器的兼容性等問題，導致在線檢測方法穩(wěn)定性較差。本研究采用UPLC使流速為0.08 mL·min-1，不分流即可滿足在線檢測的要求。

蓮子心被報道具有BChE抑制作用，按照“2.3.2”項下的方法，運用UPLC-DAD-BCD對蓮心堿抑制活性進行分析，見圖2。圖2為五個不同濃度蓮心堿的UPLC圖譜和BChE抑制峰(60，120，600，1 200和 1800 μg·mL-1)，以活性指紋圖譜的倒峰面積為橫坐標（X），蓮心堿濃度為縱坐標（Y），得到蓮心堿的量效曲線方程Y= 351.56X3-1 098.8X2+ 1 473X-32.205 (R² = 0.999 7)，表明UPLC-DAD-BCD方法能夠用于酶抑制劑的篩選和活性評價。由圖二上和下對應峰的保留時間可得在線檢測的延遲時間為2 min左右。

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