復方羅布麻片Ⅰ是由羅布麻葉、野菊花、防己3味中藥及泛酸鈣、氫氯噻嗪、維生素B6、維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、鹽酸異丙嗪組方的復方制劑，是臨床常用降血壓藥，藥效協(xié)同，成分復雜。現行質量標準中僅有氫氯噻嗪的含量測定和鹽酸異丙嗪的薄層鑒別，過于簡單，不利于產品質量的控制。本研究中參考文獻，分析了極性及穩(wěn)定性等性質來確定溶劑、固定相及流動相，最終采用高效液相色譜雙波長法同時測定該復方制劑中泛酸鈣、氫氯噻嗪及維生素B6的含量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD型高效液相色譜儀，配有LC-20AD型紫外可見光度檢測器(日本島津公司);Elmasonic P 60H型超聲儀(德國Elmasonic公司，功率為320 W，頻率為80 k Hz);XS-105型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為十萬分之一);BINDER PD60型電熱干燥箱(德國Binder公司)。

1.2 試藥

泛酸鈣對照品(批號為100370-201402，純度為97.5%)，氫氯噻嗪對照品(批號為100309-201103，純度為99.8%)，維生素B6對照品(批號為100116-201103，純度為99.9%)，均購自中國食品藥品檢定研究院;復方羅布麻片Ⅰ(某藥業(yè)集團有限公司，批號分別為151001,151002,151003);庚烷磺酸鈉、乙腈、甲醇均為色譜純，水和冰醋酸均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動相:0.12%庚烷磺酸鈉(A，冰醋酸調p H至3.0)-乙腈(B)，梯度洗脫(程序見表1);流速:1.0 mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:泛酸鈣200 nm，其他275 nm;進樣量:20μL。

2.2 溶液制備

對照品貯備液:取泛酸鈣對照品12.5 mg，氫氯噻嗪對照品16.0 mg，維生素B6對照品12.5 mg，精密稱定，分別置50 mL,10 mL,25 mL容量瓶中，泛酸鈣和維生素B6加流動相溶解稀釋，氫氯噻嗪先加2 mL甲醇超聲溶解，再加流動相稀釋至刻度，即得對照品貯備液A,B,C。

對照品溶液:精密量取上述對照品貯備液A,B,C各1 mL，分別置10,100,10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，即得對照品溶液A,B,C。

供試品溶液:取本品20片，研細，取粉末適量(約相當于氫氯噻嗪3.2 mg)精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，加流動相適量，超聲處理30 min，使其溶解，加流動相稀釋至刻度，過濾，即得。

陰性對照品溶液:按處方比例制備不含泛酸鈣、氫氯噻嗪及維生素B6的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

陰性干擾試驗:取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各適量，分別按2.1項下色譜條件進樣測定。結果對照品溶液與供試品溶液色譜在相同保留時間處有對應色譜峰出現，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

線性關系考察及檢測限與定量限測定:分別精密吸取對照品貯備液A,B,C各1,3,5,10,15,20 mL，分別置50 mL容量瓶中，流動相定容，按2.1項下色譜條件進樣測定。以峰面積(Y)為縱坐標、對照品質量濃度(X，μg/mL)為橫坐標進行線性回歸。分別以信噪比(S/N)為3∶1和10∶1為基準測得各化合物的檢測限和定量限。結果見表2。

精密度試驗:分別精密量取上述對照品溶液A,B,C各20μL，注入液相色譜儀，連續(xù)測定6次，記錄峰面積。結果泛酸鈣、氫氯噻嗪、維生素B6峰面積的RSD分別為0.34%,0.12%,0.08%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取2.2項下供試品溶液，分別于0,3,6,9,12,24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定。結果泛酸鈣、氫氯噻嗪、維生素B6峰面積的RSD分別為1.18%,0.35%,0.31%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

重復性試驗:取同一批(批號為151001)樣品6份，依法制備供試品溶液，以外標法計算泛酸鈣、氫氯噻嗪及維生素B6的含量。結果含量的RSD分別為0.31%,0.29%,0.53%(n=6)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗:取已知含量的同一批(批號為151001)樣品1片，研細取粉末，置50 mL容量瓶中，依法制備供試品溶液，分別加入對照品溶液適量，進樣20μL，測定含量，并計算回收率。結果見表3。

2.4 樣品含量測定

取樣品(批號分別為151001,151002,151003)，依法制備供試品溶液，分別精密量取20μL，進樣測定峰面積，按外標法計算含量。結果3批樣品中泛酸鈣、氫氯噻嗪、維生素B6的平均含量分別為43.26%,95.54%,52.38%。

3 討論

3.1 色譜柱選擇

曾比較Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),Agilent 5HC C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),Waters Symmetry Shield C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)的色譜圖，以分離度為優(yōu)化指標，結果4種色譜柱的分離度分別為3.125,1.875,3.075,1.950，故色譜柱選擇Kromasil C18柱。

3.2 溶劑選擇

參考文獻，氫氯噻嗪在水中不溶，在乙醇中微溶。流動相中有機相比例小，故先采用適量甲醇超聲溶解，加流動相定容。泛酸鈣極不穩(wěn)定，易降解，水溶液中顯中性或弱堿性，流動相為酸性環(huán)境，故泛酸鈣極易降解，需要及時配制。樣品中含有多種中藥，成分復雜，且流動相中離子對濃度大，故應對色譜柱進行保護。

3.3 波長選擇

因泛酸鈣無最大吸收波長，故于200 nm波長處末端吸收測定含量，另2種物質氫氯噻嗪和維生素B6的最大吸收波長分別為271 nm和291 nm?？紤]到含量測定的均衡性，確定測定波長為275 nm。因此，泛酸鈣測定波長選擇200 nm，氫氯噻嗪和維生素B6測定波長選擇275 nm。

3.4 方法評價

本研究中建立的高效液相色譜雙波長法，同時測定復方羅布麻片Ⅰ中3組分的含量，簡便易行，可操作性強，重復性好，結果準確，可用于復方羅布麻片Ⅰ中泛酸鈣、氫氯噻嗪和維生素B6的含量測定。

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