南極磷蝦，屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)甲殼亞門(mén)磷蝦目磷蝦科，又名大磷蝦或南極大磷蝦，廣泛分布于南冰洋的南極洲海域，是南極生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵物種。南極磷蝦的蘊(yùn)藏量極為豐富，約在6.5～10億噸之間，且主要生活在淺層海域，捕撈難度小，極具商業(yè)開(kāi)發(fā)潛力南極磷蝦具有典型的高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)，包含8種人體必需氨基酸，礦物質(zhì)、維生素含量豐富，并且含有多種活性成分如多酚、生物酶、蝦青素、甲殼素等，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。
多酚類(lèi)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基基團(tuán)，其酚羥基可與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，是一類(lèi)有很高抗氧化活性的天然產(chǎn)物，在化學(xué)、生物、食品、藥學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用前景。多酚類(lèi)物質(zhì)在自然界的儲(chǔ)量非常豐富，已發(fā)現(xiàn)植物中有8000余種多酚類(lèi)化合物及其衍生物?，F(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)植物多酚的研究很多，但從動(dòng)物體內(nèi)提取多酚類(lèi)物質(zhì)的研究則鮮有報(bào)道。本研究以富有開(kāi)發(fā)潛力的海洋生物資源南極磷蝦為原料，采用乙醇浸提法提取南極磷蝦體內(nèi)的多酚物質(zhì)，且通過(guò)響應(yīng)曲面優(yōu)化確定最佳提取方案，以期為進(jìn)一步研究南極磷蝦中多酚物質(zhì)的成分及功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

一、材料和方法

1、材料與試劑

南極磷蝦粉，日本水產(chǎn)有限公司。乙醇、丙酮、福林酚試劑、無(wú)水碳酸鈉、沒(méi)食子酸等均為分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

2、設(shè)備與儀器

Eppendorfminispan型離心機(jī)；恒溫水浴振蕩器；酶標(biāo)儀；電子天平。

3、實(shí)驗(yàn)方法

（1）樣品總酚含量測(cè)定

吸取1mL待測(cè)樣液，加入0.5mL福林酚試劑，充分震蕩后靜置3～4min，再分別加入0.5mL10%碳酸鈉溶液，定容至10mL，搖勻置于25℃恒溫水浴中反應(yīng)1h，以空白試劑為對(duì)照，765nm條件下測(cè)定吸光度。

（2）總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

精確稱(chēng)取0.01g烘干至恒重的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于蒸餾水中并定容至200mL。得濃度為0.05mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

準(zhǔn)確量取0.05mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL容量瓶中，加入0.5mL福林酚試劑，充分震蕩后靜置3～4min，再分別加入0.5mL10%碳酸鈉溶液，蒸餾水定容至10mL，搖勻置于25℃恒溫水浴中反應(yīng)1h，以空白試劑為對(duì)照，765nm條件下測(cè)定吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

（3）總酚含量與提取得率計(jì)算

按以下公式換算總酚含量（以沒(méi)食子酸的相當(dāng)值表示）:

式中:ω-總酚含量，mg／mL；C-沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度，mg／mL；V-提取液體積，mL；N-稀釋倍數(shù)；M-取樣量，mL。

按以下公式計(jì)算南極磷蝦總酚提取得率：

式中:Y-南極磷蝦總酚提取得率，mg／g；ω-提取總酚含量，mg／mL；V-提取液體積，mL；M'-南極磷蝦質(zhì)量。

（4）南極磷蝦多酚提取條件的確定

①乙醇濃度的選擇實(shí)驗(yàn)

分別采用不同體積分?jǐn)?shù)（0%、20%、40%、60%、80%、100%）的乙醇-水提取液，在物料比1:5、提取溫度25℃、提取時(shí)間1h條件下，提取南極磷蝦中的多酚物質(zhì)，并計(jì)算多酚提取得率。

②提取時(shí)間選擇實(shí)驗(yàn)分別采用不同的

提取時(shí)間（15min、30min、60min、120min、180min、240min），在物料比1:5、以80%乙醇為溶劑、提取溫度35℃提取條件下，提取南極磷蝦中的多酚物質(zhì)，并計(jì)算多酚提取得率。

③提取溫度選擇實(shí)驗(yàn)分別采用不同的

提取溫度（15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃），在物料比1:5、以80%乙醇為溶劑提取1h條件下，提取南極磷蝦中的多酚物質(zhì)，并計(jì)算多酚提取得率。

④物料比選擇實(shí)驗(yàn)

分別以1:3、1:5、1:7.1:9、1:11、1:13的料液比，在以80%乙醇為溶劑、提取溫度35℃、提取時(shí)間60min條件下，提取南極磷蝦中的多酚物質(zhì)，并計(jì)算多酚提取得率。

⑤響應(yīng)面確定最優(yōu)提取條件實(shí)驗(yàn)采用

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度及物料比4個(gè)因素為自變量，多酚提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)（表1）。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，建立二次響應(yīng)面分析模型，擬合得到二次回歸方程。進(jìn)行27組響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次，求取平均值，以確定最佳提取條件。

二、結(jié)果與討論

1、單因素實(shí)驗(yàn)

（1）乙醇濃度的選擇

不同乙醇濃度對(duì)多酚提取得率的影響見(jiàn)圖1。圖1表明，提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)多酚提取得率最高，體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)多酚提取得率最低。其原因可能是南極磷蝦體內(nèi)的動(dòng)物類(lèi)型多酚與磷蝦油鍵結(jié)合形成天然活性多效能復(fù)合分子，溶劑水不能使多酚與其他物質(zhì)連接的氫鍵斷裂，加入乙醇可以破壞氫鍵，乙醇含量達(dá)到一定濃度后，隨著乙醇濃度的增高，加速氫鍵斷裂使得多酚得率提高；但乙醇濃度過(guò)高會(huì)使得多酚與溶劑的極性差異變大，多酚溶解度下降，導(dǎo)致多酚提取得率降低。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文選用80%的乙醇-水溶液作為提取溶劑。
 

（2）提取時(shí)間的選擇

提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響如圖2所示。圖2表明，60min內(nèi)隨著提取時(shí)間的增加，南極磷蝦多酚得率顯著增加；60min后得率逐漸下降。其原因可能是在60min以?xún)?nèi)，細(xì)胞內(nèi)多酚快速擴(kuò)散到溶劑中，得率增加。隨著提取時(shí)間的進(jìn)一步增加，部分多酚被氧化分解，造成得率下降。因此，理想的提取時(shí)間為60min，此時(shí)多酚提取率最高。

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