霉菌是營寄生或腐生方式生存的絲狀真菌的通稱，無明顯的子實體，這一點與同樣營寄生或腐生方式生存但能形成大型子實體的蘑菇類真菌相區(qū)別。霉菌有著極強的繁殖能力，主要依靠形形色色的無性或有性孢子進行繁殖。霉菌的滋生是導(dǎo)致果蔬、糧食和食品腐敗變質(zhì)的主要原因之一，如在我國果蔬損失的25%～30%，糧食損失的10%是由霉菌滋生引起的，其數(shù)量龐大的孢子是導(dǎo)致其快速傳播繁殖的主要方式，部分霉菌還能產(chǎn)生霉菌毒素，具有致癌性或其他毒性。迄今為止，人類已經(jīng)開發(fā)了數(shù)十種的抗霉菌劑商品（保鮮劑、防腐劑）來應(yīng)對上述問題，它們在緩解果蔬、糧食和食品腐敗變質(zhì)方面發(fā)揮了無可替代的重要作用。然而，由于長期的使用，使得微生物的抗藥性也在不斷地增強，抗霉菌劑的抗菌效果正在不斷下降甚至失效，因此只有不斷地開發(fā)新的抗霉菌劑資源，多種抗霉菌劑輪換或組合使用，才能有效地應(yīng)對抗藥性，減少果蔬、糧食和食品腐敗變質(zhì)的發(fā)生。

從獼猴桃表皮分離到一株黑附球菌菌株YP1，其分泌物具有廣譜的抗霉菌活性，對多孢子植物病原真菌也具有很好的抑制效果，在果蔬、食品的保鮮防腐以及植物病害的防治領(lǐng)域顯示出很好的應(yīng)用潛力。

一、材料與方法

1、材料

備篩真菌菌株：共70株，分離于不同種類的植物體，由本研究小組分離保存；測試霉菌：為本實驗室分離保存；

植物病原菌：購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心；化學(xué)試劑：均為分析純；真菌DNA提取試劑盒、ITS1和ITS4引物：購于北京三博遠志公司。

2、儀器

島津UFLC-20A高效液相色譜儀；美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司TripleQTOF5600+質(zhì)譜儀。

3、方法

（1）拮抗菌株的初篩

黑根霉孢子萌發(fā)抑制法：將70株待篩選真菌菌株的斜面菌種活化后，接入盛有100mL液體PDA的250mL錐形瓶中，28℃靜置培養(yǎng)20d左右，棄菌絲，發(fā)酵液過濾，取9mL發(fā)酵液，加入1mL黑根霉孢子懸浮液（生理鹽水配制），混勻，另取9mL經(jīng)10倍稀釋的液體PDA，加入1mL黑根霉孢子懸浮液混勻作為對照，待測樣品與對照同時置于28℃靜置培養(yǎng)6h，懸滴法制片，于顯微鏡下統(tǒng)計孢子萌發(fā)率，通常以芽管長度超過孢子直徑的一半作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。

（2）拮抗菌株YP1的鑒定

使用真菌DNA提取試劑盒提取YP1菌株的總DNA，以總DNA為模板，以ITS1和ITS4為引物對YP1菌株的全長ITS序列進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物由北京三博遠志公司完成測序。將獲得的ITS序列送入NCBI官方網(wǎng)站，使用BLAST程序進行在線比對，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確認YP1菌株的最終分類學(xué)地位。

（3）拮抗菌株YP1外分泌物的發(fā)酵制備

將YP1菌株斜面菌種活化后，接入盛有100mL液體PDA的250mL錐形瓶中，10瓶共1000mL培養(yǎng)液，28℃靜置培養(yǎng)20d左右，棄菌絲，發(fā)酵液過濾后合并，用HCl調(diào)pH至4.5，1/4體積乙酸乙酯萃取2遍，發(fā)酵液中橙黃色物質(zhì)全部轉(zhuǎn)入乙酸乙酯中，合并乙酸乙酯相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后，倒入廣口皿中用吹風(fēng)機吹干，得橙黃色膠狀固體，稱量計算產(chǎn)量。取部分固體進行簡單的溶解性和光熱穩(wěn)定性分析。

（4）拮抗菌株YP1外分泌物對各種霉菌的拮抗效果分析

①對霉菌孢子萌發(fā)的影響

準(zhǔn)確稱量200mg分泌物固體，將其溶解于稀Na2CO3溶液中，用稀鹽酸將溶液的pH調(diào)至7.5作為母液備用，母液終體積為50mL，終濃度為4g/L。取上述分泌物母液適量，加入到適量體積液體PDA中，使液體PDA中分泌物終濃度達到200mg/L，以不加分泌物的液體PDA作為對照，兩種培養(yǎng)基分裝編號。將不同霉菌的孢子懸浮液一式兩份分別加入到上述兩種培養(yǎng)基中，混勻，于28℃靜置培養(yǎng)6h，懸滴法制片，于顯微鏡下統(tǒng)計孢子萌發(fā)率。

②對霉菌平板生長的影響

將固體PDA培養(yǎng)基熔化，冷卻至50～60℃時，將上述分泌物母液通過無菌過濾器加入到PDA培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中分泌物終濃度達到200mg/L，充分混勻后倒平板，將各種供試霉菌菌餅（5mm）分別接入上述已經(jīng)混有分泌物的PDA平板中央，對照PDA平板不加分泌物，接種霉菌菌餅后作為對照，置于28℃條件下培養(yǎng)，由于不同霉菌生長速度不同，每種霉菌在對照平板接近長滿時即停止培養(yǎng)，拍照留底。

（5）拮抗菌株YP1外分泌物的化學(xué)組成分析

將拮抗菌株YP1外分泌物復(fù)溶于乙酸乙酯（添加0.1%體積的濃鹽酸酸化）中，使其濃度達到0.2mg/mL，取5μL上樣于高壓液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，對其化學(xué)成分進行分離和鑒定，高壓液相采用XDB-C18柱，甲醇（0.1%甲酸+5mM乙酸銨）作洗脫劑，流速0.2mL/min，質(zhì)譜儀選用ESI電離源，掃描范圍：50～2000m/z。

二、結(jié)果與分析

1、拮抗菌株的初篩

采用黑根霉孢子萌發(fā)抑制法從70個真菌菌株中初步篩選到一株對黑根霉的孢子萌發(fā)具有強烈抑制效果的真菌菌株YP1，其發(fā)酵濾液處理黑根霉孢子，孢子萌發(fā)率為0，而對照萌發(fā)率為93%，依據(jù)如下公式計算抑制率為100%。

孢子萌發(fā)抑制率=（對照孢子萌發(fā)率–處理孢子萌發(fā)率）/對照孢子萌發(fā)率2、拮抗菌株YP1的鑒定以真菌DNA提取試劑盒提取到的YP1菌株的總DNA為模板，以ITS1和ITS4為引物，通過PCR擴增獲得了YP1接近全長的ITS序列，測序后送入NCBI官方網(wǎng)站，使用BLAST程序進行在線比對，結(jié)果顯示其與附球孢菌屬的黑附球菌具有最高的相似性（99%），同時YP1菌株的形態(tài)和生理特征與王宇等和Fávaro等對黑附球菌的描述一致，因此將其鑒定為黑附球菌。

在PDA平板上，YP1菌落平展，菌絲體大部分埋生，初期僅表面為橙黃色，后期整個菌落都變?yōu)槌赛S色乃至棕黃色，培養(yǎng)基的顏色也由無色變?yōu)槌赛S色至后期為深棕黃色。分生孢子產(chǎn)生較少，不易被觀察，單生，頂生，球形或梨形，深褐色。

3、拮抗菌株YP1外分泌物的發(fā)酵制備及其溶解性、穩(wěn)定性分析

YP1菌株在液體發(fā)酵過程中可向PDA培養(yǎng)基中分泌橙黃色物質(zhì)，用鹽酸調(diào)整發(fā)酵液pH4.5，經(jīng)乙酸乙酯萃取、減壓濃縮、吹干，得橙黃色膠狀固體，產(chǎn)量為463mg/L（靜置培養(yǎng)20d產(chǎn)量），分泌物易溶于極性有機溶劑，在水中的溶解性隨著pH的升高而迅速增強，pH5以下難溶于水。分泌物水液對紫外線、強烈日光或120℃以上溫度敏感，處理后褪色成為無色物質(zhì)，在100℃以下溫度時比較穩(wěn)定，干燥固體則不受前述因素影響，表現(xiàn)穩(wěn)定。

4、拮抗菌株YP1外分泌物對各種霉菌的拮抗效果分析

以不摻分泌物的液體PDA為對照，通過分泌物摻入和孢子懸浮培養(yǎng)，觀察不同霉菌孢子的萌發(fā)情況，計算摻入分泌物對霉菌孢子萌發(fā)的抑制效果（表1）。

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