2.2.3 因素交互作用

利用DesignExpert8.0.6，根據(jù)回歸方程，生成等高線和響應(yīng)面圖，并考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析pH、料液比、提取時(shí)間對LCP得率的影響。在響應(yīng)面圖中，曲線變化越陡峭，說明交互影響越顯著。從圖2～圖4可見，三個(gè)因素在所選范圍內(nèi)存在極值，即等高線中最小橢圓的中心點(diǎn)。結(jié)果表明，BC交互作用顯著，與F值結(jié)果一致。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)軟件分析，該模型得到的最優(yōu)條件為：料液比1:15.65（g/mL）、提取時(shí)間1.58h、pH6.23。且預(yù)測LCP得率理論值為2.35%。考慮到實(shí)際操作的可能性，將試驗(yàn)條件修正為：料液比為1:15（g/mL）、提取時(shí)間1.5h、pH6。在該修正條件下進(jìn)行3次提取試驗(yàn)，平均蛋白質(zhì)得率為（2.36%±0.13%），接近理論值。表明該數(shù)學(xué)模型可用于優(yōu)化LCP質(zhì)提取過程。

2.3 SDS-PAGE凝膠電泳

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，Tris-HCl所提LCP的分子量分布在17～48kDa之間，較之月見草蛋白（16～200kDa）、榴蓮蛋白（20～100kDa）、向日葵蛋白（300～350kDa）、扁豆蛋白（50～80kDa），LCP分子量較小。有研究提取不同蘑菇中的蛋白質(zhì)并進(jìn)行抗氧化研究，結(jié)果表明分子量較小的蛋白質(zhì)抗氧化能力較強(qiáng)?；钚匝踝杂苫梢哉T導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，因其易與蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)衍生化合物相關(guān)的反應(yīng)可能發(fā)生在含有組氨酸的側(cè)鏈上，使蛋白質(zhì)分子具有抗氧化活性。

2.4 等電點(diǎn)測定

在等電pH條件下，蛋白質(zhì)分子上的電荷缺失降低了蛋白質(zhì)分子之間的排斥力，從而促進(jìn)了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，蛋白質(zhì)沉淀，溶解性降低，最終降低其他功能特性。試驗(yàn)中制備的LCP提取物在pH為3.88時(shí)沉淀最多，如圖6所示，pH3.88與其余pH的蛋白沉淀量之間存在顯著差異（P＜0.05），因此pH3.88可能是LCP的pI，這可以為分離和純化中選擇離子交換劑或凝膠色譜試劑及后續(xù)研究提供基礎(chǔ)，因等電點(diǎn)附近加熱可以更好地控制蛋白質(zhì)的溶解度，可通過加熱控制蛋白質(zhì)變性和聚集的程度來增強(qiáng)蛋白質(zhì)的功能。

2.5 溶解度

蛋白質(zhì)溶解度是蛋白質(zhì)變性和結(jié)構(gòu)改變程度的指標(biāo)，也是蛋白質(zhì)功能的良好指標(biāo)。pH為8（圖7）時(shí)，LCP的溶解度為96%。LCP在pH3～4之間溶解度最小，當(dāng)pH偏離pI時(shí)，蛋白溶解度增大。在pH8下觀察到較高的溶解度，可能是由于高pH條件下LCP部分水解導(dǎo)致末端殘基增多，這些殘基有利于蛋白質(zhì)分子與水的親水性相互作用，如氫鍵和靜電相互作用。

2.6 LCP體外抗氧化試驗(yàn)

由圖8（a）可知，在0.3～1.5mg/mL范圍內(nèi)，LCP的羥自由基清除能力隨著濃度的增大而增強(qiáng)，當(dāng)其濃度達(dá)到1.5mg/mL時(shí)，羥自由基清除率為60%。陽性對照組V_C的IC₅₀值為0.72mg/mL，計(jì)算得到LCP清除羥自由基的IC₅₀值為1.18mg/mL，由此可知，雖清除效果弱于陽性對照組，LCP具有一定的羥自由基清除能力。
 

由圖8（b）可知，LCP對超氧陰離子自由基的清除能力在0.3～1.5mg/mL的濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增大而增強(qiáng)，呈現(xiàn)較為明顯的量效關(guān)系，當(dāng)其濃度達(dá)到1.5mg/mL時(shí)，超氧陰離子自由基清除率達(dá)到78%，清除能力與1.5mg/mLV_C相當(dāng)。通過計(jì)算可知LCP清除超氧陰離子自由基的IC₅₀值為0.57mg/mL，V_C的IC₅₀值0.26mg/mL。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，LCP具有良好的超氧陰離子清除能力，并呈劑量依賴性，活性隨蛋白質(zhì)濃度的增加而增加，但不呈線性關(guān)系，推測是蛋白質(zhì)不完全溶解所致。而超氧自由基能間接誘導(dǎo)脂質(zhì)氧化而促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展和生長。推測LCP可作為一種潛在的預(yù)防心血管疾病的天然抗氧化劑進(jìn)一步研究。

由圖8（c）可知，隨著濃度的增加，LCP的DPPH自由基清除率逐漸增大，二者呈正相關(guān)性，當(dāng)濃度為1.5mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到最大值58.3%。但與陽性對照組V_C（IC₅₀值為0.16mg/mL）相比，LCP（IC₅₀值為1.31mg/mL）清除羥自由基的能力較弱，推測LCP可能含有較高疏水氨基酸所致。

LCP顯示出良好的抗氧化活性，可能是由于LCP中含的氨基酸部分水解，能夠向自由基提供質(zhì)子，從而顯示出抗氧化能力；在適當(dāng)?shù)膒H條件下提取的LCP，屬小分子量的蛋白質(zhì)，亦可能是增強(qiáng)抗氧化活性的一個(gè)原因。

3 結(jié)論

蛋白來源豐富，種類繁多，在食品及醫(yī)療行業(yè)的應(yīng)用廣泛。天然蛋白質(zhì)是動植物體內(nèi)的重要大分子物質(zhì)，具有維持細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)識別、細(xì)胞粘附、蛋白質(zhì)的加工和轉(zhuǎn)移等生物活性功能和生物活性。本研究首次從中藥川芎中分離蛋白質(zhì)，單因素結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化LCP提取工藝結(jié)果表明，在pH6、料液比1:15、提取1.5h條件下提取LCP，得率為（2.36%±0.13%），Tris-HCl法可以用于LCP提取。同時(shí)對其理化特性進(jìn)行了研究，SDS-PAGE電泳表明，LCP的分子量分布在17～48kDa之間。LCP的pI約為pH3.88；pH為8時(shí)，LCP的溶解度為96%。通過探索的LCP的分子量、等電點(diǎn)、溶解度等功能特性，可為其進(jìn)一步研究提供一定的研究基礎(chǔ)，為其在食品工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

機(jī)體細(xì)胞的癌變，衰老及其它疾病都與機(jī)體內(nèi)自由基的過量產(chǎn)生有直接的密切聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，LCP具有良好的抗氧化活性，羥自由基清除能力IC₅₀為1.18mg/mL、超氧陰離子自由基清除能力IC₅₀為0.57mg/mL、1，1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH）自由基清除能力IC₅₀為1.31mg/mL。且屬于天然產(chǎn)物，具有比較高的安全性，可作為一種潛在的天然抗氧化劑源。本研究為川芎合理開發(fā)和應(yīng)用提供了一些基礎(chǔ)資料，也為開發(fā)植物源的天然抗氧劑奠定了良好的基礎(chǔ)。

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