2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱

親水作用色譜（HILIC）在針對強極性及強親水性化合物的保留方面具有優(yōu)勢，可以較好地分離氨基酸等具有生物活性的極性物質(zhì)。經(jīng)過對多個色譜參數(shù)的優(yōu)化，HILIC色譜柱分離必需氨基酸的效果要優(yōu)于C₁₈柱，且降低了基質(zhì)效應(yīng)的影響，峰形得到優(yōu)化，拖尾現(xiàn)象明顯減少，因此最終選擇AccucoreHILIC色譜柱。

2.1.2 流動相

甲酸和高比例水相均可提高離子化率，通過對比發(fā)現(xiàn)等度洗脫與梯度洗脫無明顯差異，所以采用含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的55%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇水溶液進行等度洗脫。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用蠕動針泵，以10μL/min的流量，依次將1μg/mL單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液與流量為200μL/min的流動相通過三通接頭混合后，直接注入質(zhì)譜儀，在質(zhì)荷比m/z為100～500掃描范圍內(nèi)，以ESI⁺模式，進行一級質(zhì)譜掃描，調(diào)節(jié)離子源溫度、噴霧電壓、離子傳輸管溫度和氣體流量等質(zhì)譜參數(shù)，確定8種必需氨基酸的母離子。結(jié)果表明，8種必需氨基酸的母離子均為［M+H］⁺峰。確定母離子后，分別對其進行二級質(zhì)譜掃描，選擇合適的轟擊能量，確定定量離子和定性離子。優(yōu)化后8種必需氨基酸的MRM質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 樣品前處理方法優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

在樣品中分別加入0.01mol/L鹽酸（pH=2）、60%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液、含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的25%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇溶液和超純水，再經(jīng)過1.3樣品處理步驟進行提取，檢測后發(fā)現(xiàn)超純水的提取效率更高，因此選用超純水為提取液。

2.3.2 稱樣質(zhì)量的選擇

分別測試了0.2g、0.5g和1g3種取樣量，由于馬鈴薯中氨基酸含量較大，為避免取樣量過小而導(dǎo)致誤差增大，所以最終確定取樣量為1g，然后增大稀釋倍數(shù)。

2.4 線性方程和檢出限

將1.3.2中8種必需氨基酸的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按照1.2色譜及質(zhì)譜工作條件進行測定，以各物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)（y）、8種必需氨基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。當(dāng)取樣量為1g時，以信噪比分別為3和10時的進樣濃度為方法的檢出限和定量限。8種必需氨基酸的線性范圍、線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限見表2。由表2可知，8種必需氨基酸在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.9990～0.9996，檢出限為0.04～1.50mg/kg，定量限為0.12～4.99mg/kg，表明該方法具有較高的靈敏度。

2.5 精密度與加標(biāo)回收試驗

按照1.3方法對樣品進行處理，在1.2儀器工作條件下測定馬鈴薯樣品中8種必需氨基酸的含量，作為本底值。再精密稱取已處理好的馬鈴薯樣品18份，分別進行3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗，在1.2儀器工作條件下，對每個水平進行6次平行測定，8種必需氨基酸的精密度與加標(biāo)回收試驗結(jié)果見表3。由表3可知，8種必需氨基酸的平均加標(biāo)回收率為89.9%～115.1%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～4.6%，表明該方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，滿足分析要求。

2.6 實際樣品測定

選?。捶N不同品種及產(chǎn)地的馬鈴薯，按照1.3方法進行樣品處理與制備，在1.2儀器工作條件下進行測定，馬鈴薯樣品中8種必需氨基酸試驗結(jié)果如表4所示。由表4可知，不同產(chǎn)地的4種馬鈴薯均含有豐富的必需氨基酸，其中，賴氨酸的含量高于其它幾種必需氨基酸，而賴氨酸被譽為人體第一必需氨基酸，2007年，WHO/FAO/UNU專家委員會確定成人賴氨酸每天需要量為30mg/kg，食用馬鈴薯可以很好地提高賴氨酸及其它必需氨基酸的攝入量。

3 結(jié)語

建立了同時測定馬鈴薯中8種必需氨基酸的超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法樣品處理簡單、靈敏度高、檢測效率高，有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度，可為其它種類的馬鈴薯及其食品中必需氨基酸的檢測提供參考，并可為馬鈴薯品種育種及優(yōu)選提供重要依據(jù)。

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