多花指甲蘭為蘭科指甲蘭屬附生草本植物，花型奇特，狀似“狐尾”，花序密集，花大部白色，稍有紫色點綴其間，觀賞價值高。更重要的是，多花指甲蘭極具芳香，獨特的芳香性狀也是多花指甲蘭的重要價值之一。其含有醛類、芳香族類、酯類、酮類以及萜類化合物等多種揮發(fā)性物質(zhì)，可廣泛應(yīng)用于化妝品、美容等行業(yè)，近年，一家日本公司公布了其香水專利，構(gòu)成其產(chǎn)品成分的一種主要香味物質(zhì)便來自于此。同時，多花指甲蘭也是重要的藥用蘭花，在印度東北部當(dāng)?shù)夭柯渚用裼惺褂弥讣滋m屬植物治療常見疾病的習(xí)俗，孟加拉國和泰國也有相關(guān)報道，國內(nèi)研究人員也發(fā)現(xiàn)指甲蘭屬植物有作為抗癌藥物潛能。多花指甲蘭不僅擁有花型、花色和香味等眾多優(yōu)良性狀，是不可多得的優(yōu)秀親本資源，而且在醫(yī)藥業(yè)、化工業(yè)也廣泛運用，具有重大開發(fā)潛能。多花指甲蘭常附生于喬木上，由于過度的資源開采、旅游開發(fā)等生態(tài)破壞行為，以及對其附生樹種的亂砍濫伐、野生植物非法貿(mào)易，導(dǎo)致多花指甲蘭野生種群的生存面臨極大威脅。CITES（《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》）將指甲蘭屬的所有種列入其附錄Ⅱ的保護對象。我國也將其列入國家重點野生植物保護名錄（第二批次）。我們應(yīng)積極對其采取相關(guān)保護措施。但由于種質(zhì)資源匱乏等原因，國內(nèi)目前較少見到多花指甲蘭的相關(guān)報道，花粉形態(tài)觀察和花粉活力測定以及柱頭可授性更是鮮有報道，還有極大的挖掘空間。

花粉和柱頭具有較高的活性是雜交育種成功的關(guān)鍵，目前，國內(nèi)外主要使用花粉染色法和花粉離體培養(yǎng)測定花粉活力。常見染色方法有醋酸洋紅染色法、I₂-IK染色法和TTC染色法。據(jù)文獻報道，最符合真實值的方法為TTC染色法；而花粉離體培養(yǎng)是最能反映真實值的方法。柱頭可授性均利用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定。當(dāng)前，僅有少數(shù)研究人員以市場上常見的幾種蘭花為材料進行了花粉形態(tài)、花粉活性以及柱頭可授性的研究。褚怡等研究了大花蕙蘭和幾種國蘭的花粉活力和柱頭可授性，喻蘭等對蝴蝶蘭的花粉活力和柱頭可授性進行了測定。羅遠(yuǎn)華等以20個文心蘭種質(zhì)為材料，對花粉活力進行測定。這些研究明確了各材料最佳的授粉時機，為蘭花的雜交育種、引種栽培提供了理論指導(dǎo)。本文在前人的基礎(chǔ)上對多花指甲蘭的花粉形態(tài)、花粉活力以及柱頭可授性開展研究，以期為多花指甲蘭的雜交引入、遷地保護以及后續(xù)的應(yīng)用開發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源于云南省瀾滄縣（99°29′E～100°35′E、22°01′N～23°16′N之間），為野生種，目前種植于海南大學(xué)育苗基地（20°03′N，110°19′E）。使用試劑為氯化三苯基四氮唑（TTC）、I2-KI以及醋酸洋紅染液。試驗器材為鑷子、解剖針、解剖刀、蓋玻片、載玻片、10mL離心管、恒溫培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡（BA210-T）等。

1.2 方法

1.2.1 多花指甲蘭花粉電鏡掃描

采集花蕾期、盛花期、衰敗期的多花指甲蘭花粉（圖1），經(jīng)離子濺射儀噴金后，置于場發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察（S-4800）。選取各時期花粉在30×、100×、500×的視野下觀察并對各開花時期花粉塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)進行拍照記錄。

1.2.2 花粉活力染色測定

結(jié)合胡適宜與羅遠(yuǎn)華等的方法，并在此基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，具體為用pH為7.2～7.4的10×0.01mol/L磷酸緩沖液配0.5%的TTC溶液、I2-KI以及醋酸洋紅染液取不同開花時期新鮮花粉團，將花粉搗碎于載玻片上，用鑷子與解剖針使之充分分散，然后滴加適量新鮮配制的TTC染色液、I₂-KI以及醋酸洋紅染液，蓋上蓋玻片，用錫箔紙包裹黑暗處理置于35℃恒溫箱中。24h后在光學(xué)顯微鏡下觀察統(tǒng)計花粉活力，每張片子隨機計數(shù)5個視野的染色率，染成紅色的為活力強的花粉，淡紅色為活力弱的花粉，無活力或不育的花粉無法被染色。

1.2.3 花粉離體萌發(fā)

以錢鑫等、郭麗霞等的研究為基礎(chǔ)對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，預(yù)實驗結(jié)果表明，最適培養(yǎng)基為：20%蔗糖+20mg/L硼酸+10mg/LCaCl2，在25℃恒溫中暗培養(yǎng)48h之后于光學(xué)顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，以花粉管長度超過花粉粒直徑的2倍為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，并選擇3個視野進行計數(shù)。

1.2.4 柱頭可授性檢測

用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定多花指甲蘭柱頭活性。聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液用1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。取不同開花時期的新鮮雌蕊柱頭，放入培養(yǎng)皿中，加入檢測液使之沒過柱頭，反應(yīng)10min。在體視顯微鏡下觀察氣泡產(chǎn)生情況以及柱頭變色情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoftoffice2010及GraphPadPrism8分析軟件進行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多花指甲蘭花粉電鏡掃描結(jié)果

與其他形態(tài)和生理特征相比，花粉形態(tài)保持相對穩(wěn)定，因此花粉形態(tài)可以作為更好的分類和系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記。多花指甲蘭花粉團附著于有柄的粘盤上，花粉呈黃色，蠟質(zhì)，2個。在掃描電鏡下可以清晰的觀察到每個具半裂的裂隙，表面稍有凹陷，無紋飾，近球形（圖2A），粘盤柄狹長，粘盤較寬（圖3A）。每個花粉團均由大量形狀不規(guī)則花粉粒通過類脂質(zhì)粘合而成。由圖2～圖4和表1可知，隨著開花時間延長，花粉粒皺縮，體積變小，整個花粉團體積也相應(yīng)變小，花粉團表面變得更加緊密平滑。尤其是開花10d后時，即衰敗期，花粉粒表面致密平滑。

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