表沒食子兒茶素沒食子酸酯，是兒茶素中含量最高活性最強(qiáng)的成分，也是綠茶利好人體健康的主要承擔(dān)者。兒茶素的結(jié)構(gòu)特征是B-環(huán)上有二個(gè)或三個(gè)羥基基團(tuán)和A-環(huán)上的5，7-二羥基基團(tuán)，因此具有抗氧化活性。EGCG除上述兩個(gè)環(huán)上的羥基外，還在D-環(huán)上帶有三個(gè)羥基，在四種主要的兒茶素中，其抗氧化活性最強(qiáng)。EGCG不僅可以直接清除胞內(nèi)活性氧/氮離子，還能螯合幾種具有強(qiáng)正電荷的金屬離子；其可使鐵離子失活，抑制超氧化物驅(qū)動(dòng)的芬頓反應(yīng)；抑制H₂O₂形成和脂質(zhì)過氧化。因此，大多研究認(rèn)為EGCG對人體健康的利好效應(yīng)源于其卓越的抗氧化能力。

然而，由于EGCG特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，穩(wěn)定性較差，可發(fā)生自動(dòng)氧化和異構(gòu)反應(yīng)，根據(jù)所處條件(EGCG濃度、pH、溫度和含氧景等)其反應(yīng)取向不同。當(dāng)EGCG自動(dòng)氧化形成多聚物時(shí)，可能產(chǎn)生如H₂O₂一類的活性氧，表現(xiàn)出促氧化活性。有研究發(fā)現(xiàn)，50μmol/LEGCG在無細(xì)胞的McCoy’S5A培養(yǎng)基中120min，培養(yǎng)基中的H₂O₂達(dá)到峰值25μmol/L。用相同的條件處理HT-29細(xì)胞30min后培養(yǎng)體系中的H₂O₂水平達(dá)到最高水平10μmol/L，在活體中，也觀察到了EGCG的促氧化效應(yīng)，用高劑量的EGCG喂食小鼠，出現(xiàn)劑量依賴的肝臟毒性。但EGCG的促氧化效應(yīng)在不同的細(xì)胞和動(dòng)物模型中并沒有得到一致的結(jié)論。Sheng等發(fā)現(xiàn)200μmolZL的H202能顯著誘導(dǎo)正常人心臟成肌細(xì)胞H9c2凋亡，而EGCG可抑制H₂O₂介導(dǎo)的H9c2凋亡，用EGCG單獨(dú)處理H9c2時(shí)并未觀察到胞內(nèi)外的H₂O₂水平的變化。

因此，本文解析EGCG氧化聚合的環(huán)境條件，及其穩(wěn)定性變化對受試細(xì)胞氧化還原平衡的影響，為進(jìn)一步探討EGCG在細(xì)胞培養(yǎng)體系及活體中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人正常結(jié)腸上皮NCM460細(xì)胞購白中科院昆明動(dòng)物所細(xì)胞庫；EGCG粉末購白sigma公司；過氧化氫檢測試劑盒(S0038)購白上海碧云天公司。

MCO-5AC培養(yǎng)箱SANYO；318C酶標(biāo)儀上海三科儀器；NanoPhotometerN60分光光度計(jì)IMPLEN；VANOX-S顯微鏡0TⅣPUS。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑配制

1.2.1.1 EGCG溶液

0.15gEGCG粉末融人10mL的三蒸水中攪拌均勻配制成32mmol/L的EGCG溶液，在超凈T作臺(tái)利用0.2μm針頭濾器進(jìn)行無菌過濾。待實(shí)驗(yàn)丌始前將EGCG溶液儲(chǔ)存液稀釋至如表1所需濃度。

1.2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)基

RPMll640或DMEM培養(yǎng)液Gibco，含10％胎牛血清Gibco；0.1％雙抗(10萬單{立/mL)Gibco；1％L-谷氨酰胺(200mmol/L)Gibco。

1.2.1.3 其他

細(xì)胞磷酸緩沖液(PBS)Gibco；0.4％臺(tái)盼藍(lán)Solarbio，0.25％胰蛋白酶Gibco。

1.2.2 影響EGCG氧化聚合的環(huán)境因素分析

1.2.2.1 溶液環(huán)境對EGCG聚合的影響

實(shí)驗(yàn)選擇了H₂O、RPMll640、DMEM(pH=7)三種溶液體系，分別加入不同濃度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L)，置于37℃培養(yǎng)箱恒溫反應(yīng)24h后，吸取三個(gè)重復(fù)的150μL溶液置于96孔板中，檢測578nm的OD值，以確定溶液體系對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.2.2 溫度環(huán)境對EGCG聚合的影響

實(shí)驗(yàn)以RPMll640(pH=7)為溶液體系，分別加入不同濃度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L)，置于37℃培養(yǎng)箱和74℃的水浴鍋中恒溫反應(yīng)24h后，吸取三個(gè)重復(fù)的150μL溶液置于96孔板中，檢測578nm的OD值，以確定溫度對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.2.3 時(shí)間對EGCG聚合的影響

實(shí)驗(yàn)以RPMI1640(pH=7)為溶液體系，加入320μmol/L的EGCG，置于37℃培養(yǎng)箱恒溫反應(yīng)3、6、12、24h后，各組吸取三個(gè)重復(fù)的150μL溶液置于96孔板中，檢測578nm的OD值，以確定時(shí)問對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.2.4 pH對EGCG聚合的影響

實(shí)驗(yàn)選用RPMI1640和H20為兩種溶液體系，分別設(shè)置不同的pH(pH=5和9)，加入不同濃度的EGCG(0、20、80、320μmol/L)，分別置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫處理24h后，各組吸取三個(gè)重復(fù)的150μL溶液置于96孔板中，檢測578nm的OD值，以確定pH對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.3 EGCG在培養(yǎng)系統(tǒng)中對NCM460細(xì)胞的胞內(nèi)、外H₂0₂濃度影

響接種6個(gè)含NCM460的6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁生長后，更換含有不同濃度EGCG(0、20、40、80μmol/L)的RPMll640培養(yǎng)液，每個(gè)6孔板培養(yǎng)時(shí)間分別為l、2、3、6、12、24h，在對應(yīng)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)先取各孔上層培養(yǎng)液50μL，用于胞外H₂0₂濃度檢測。之后，弁去含EGCG培養(yǎng)基，胰酶消化后用1mLRPMI1640培養(yǎng)基吹打混勻形成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，吸取5×105個(gè)細(xì)胞，用于胞內(nèi)H₂0₂濃度檢測。

1.2.4 H₂0₂濃度檢測

按照過氧化氫檢測試劑盒操作步驟，檢測小同濃度EGCG處理各時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)上清及細(xì)胞內(nèi)H202濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理歸納，利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單兇素方差分析，采用GrahPadPrism5制圖軟件作圖分析。

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