1 前言

銀柴胡是我國常用中藥材，為石竹科植物銀柴胡的干燥根，別名銀胡、山菜根、土參等，主要分布于寧夏、內(nèi)蒙古等地。銀柴胡微寒味甘，臨床常應(yīng)用于治療小兒疳積發(fā)熱、久病發(fā)熱、陰虛潮熱、感冒高熱等疾病，《證治準(zhǔn)繩》清骨散中提到銀柴胡和其他中藥可治骨蒸勞熱，《本草匯言》中說銀柴胡治男婦虛勞發(fā)熱，或咳或不咳。銀柴胡富含甾醇類、黃酮類、揮發(fā)性物質(zhì)、生物堿類和酚酸類等活性物質(zhì)，具有抗炎、抗癌、擴(kuò)張血管等作用。黃酮類物質(zhì)有較強(qiáng)的抗氧化作用，具有抗衰老、抗癌，降低膽固醇，降血糖及抗炎等多種功效。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道銀柴胡具有多種黃酮類化合物，但對不同產(chǎn)地銀柴胡提取物中的黃酮含量及其抗氧化性研究尚未見到，本研究通過比較不同產(chǎn)地中黃酮的含量及其抗氧化性，為銀柴胡的進(jìn)一步的應(yīng)用及研究提供參考。

2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

中藥材銀柴胡，分別購于寧夏回族自治區(qū)固原市隆德縣種植戶，陜西省榆林市種植戶，內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市五原縣種植戶。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

蘆丁對照品（成都德斯特生物技術(shù)有限公司，含量98%）；AB-8大孔樹脂；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；純化水；濾紙（撫順市民政濾紙廠）；容量瓶、錐形瓶。

2.3 實(shí)驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀（SynergyH1，美國Biotek）；電子分析天平（AEG-220型，日本島津有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000型，上海亞榮生化儀器廠）；高速離心機(jī)（ThermoSorvallLYNX4000高速落地離心機(jī)，美國Thermo）；Dragonlab移液槍（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（HH，金壇市金成國勝試驗(yàn)儀器廠）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 銀柴胡提取物的制備

取銀柴胡藥材粉碎，過40目篩，取100g粉末加入8倍60%乙醇加熱回流3h，過濾得一次濾液，濾渣加入6倍60%乙醇加熱回流2h，過濾得二次濾液，合并兩次濾液，于25℃下6000r/min離心15min，取上清液加純水至100g；提取液用AB-8大孔樹脂吸附，80%乙醇洗脫，洗脫液低溫真空濃縮至5g，得到銀柴胡提取物，于4℃冰箱保存。

3.2 黃酮含量測定

采用紫外分光光度法。

3.2.1 對照品蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取10mg蘆丁，置于50mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，制得0.20mg/mL的溶液。

3.2.2 供試品溶液的制備

稱取銀柴胡提取液1mL置于50mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，再稱取上述溶液1mL置于10mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，得供試品溶液。

3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8mL于10mL容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，靜置5min，加0.3mL的10%的硝酸鋁溶液，放置5min，再加1mol/LNaOH2mL，并用60%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置6min，以60%乙醇溶液作為空白對照，于360nm處分別測定其吸光度（A）值。

A值為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2.4 樣品總黃酮含量測定

吸取1mL供試樣品溶液，分別置10mL棕色量瓶中，按照“加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL”及之后的步驟加入試劑，于360nm處分別測定其吸光度（A）值。精密稱取樣品1mL，分別置10mL棕色量瓶中，加入60%乙醇至刻度，搖勻，得到對照組溶液，于360nm處分別測定其吸光度（A）值，根據(jù)蘆丁濃度和吸光度值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.0445x-0.0057，

R²=0.9996，在0.002～0.016mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，根據(jù)方程，可以計(jì)算銀柴胡總黃酮含量。

3.3 抗氧化能力測定

3.3.1 ABTS自由基清除能力測定

a.試劑配制

ABTS溶液：稱取0.0192gABTS（2，2′-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽），加入5mL去離子水溶解混勻得到ABTS溶液。

過硫酸鉀溶液：稱取0.1892g過硫酸鉀，加入5.00mL去離子水溶解，混勻。將5mL的ABTS溶液和88µL過硫酸鉀溶液混合，在室溫避光的條件下靜置12～16h形成ABTS自由基儲(chǔ)備液。使用前取1000µLABTS自由基儲(chǔ)備液，加24mL乙醇水溶液，稀釋25倍。

b.實(shí)驗(yàn)步驟

向A組試管依次加入500µL待測液，將500µL乙醇水溶液加入B組試管，加完試劑及時(shí)蓋帽，渦旋混勻。將500µLABTS自由基儲(chǔ)備溶液依次加入A試管和B試管中，加完試劑及時(shí)蓋帽，渦旋混勻，反應(yīng)10min后在734nm檢測A組吸光值和B組吸光值。向C組試管依次加入500µL待測液和500µL乙醇水溶液渦旋混勻，734nm處測吸光值，陽性對照為抗壞血酸。

c.計(jì)算方法
 

式中：OD_A為加樣品溶液的吸光度值；

OD_B為加乙醇水溶液的吸光度值；

OD_C為不加ABTS自由基儲(chǔ)備液的吸光度值。

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