沙門氏菌（Salmonella）是一種無芽孢、無莢膜的腸桿菌科革蘭氏陰性直桿菌，廣泛存在于人和動(dòng)物腸道中，是全球范圍導(dǎo)致食源性疾病爆發(fā)的重要病原菌之一。在美國等發(fā)達(dá)國家，沙門氏菌感染的年發(fā)病率高達(dá)15.4%，由沙門氏菌引起的疾病爆發(fā)和住院治療均高于其他食源性細(xì)菌。在中國，每年約3億人次因感染沙門氏菌而患病，達(dá)病原菌食源性疾病總數(shù)的70%～80%，給食品安全和消費(fèi)者健康帶來嚴(yán)重危害。

質(zhì)粒是獨(dú)立于染色體外、可自主復(fù)制、通常攜帶多種抗性和毒力基因的閉合環(huán)狀雙鏈DNA，質(zhì)粒的存在可使宿主菌產(chǎn)生耐藥性和致病性等附加特性。其中，接合質(zhì)粒是一種與耐藥基因水平傳遞和細(xì)菌耐藥性獲得的重要可移動(dòng)元件。在眾多質(zhì)粒中，IncI1型質(zhì)粒有助于blaCTX-M-1基因在禽類和人之間散播，IncN型質(zhì)粒已被歐洲多個(gè)國家的研究者報(bào)道攜帶blaCTX-M-1基因。

本研究以分離于我國部分省市的食源、人源和動(dòng)物源沙門氏菌為材料，篩選攜帶IncI1和IncN質(zhì)粒的菌株，闡明IncI1和IncN質(zhì)粒在沙門氏菌中的流行狀況，質(zhì)粒陽性菌株的藥敏性、與（氟）喹諾酮抗生素耐藥相關(guān)基因和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBLs）編碼基因的檢出情況以及該2 種質(zhì)粒通過水平轉(zhuǎn)移傳播耐藥基因和耐藥性的水平，以期為保障微生物食品安全問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

表1 菌株信息

所用菌株為實(shí)驗(yàn)室保存的分離于北京、上海、福建、河南、四川、廣東、廣西、陜西和新疆等地各類零售食品、臨床病人和食品性動(dòng)物的沙門氏菌（n=956）以及香港理工大學(xué)惠贈(zèng)的攜帶IncI1（n=12）和IncN（n=2）的人源性沙門氏菌（表1）。

1.1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）瓊脂、LB肉湯、Mueller Hinton瓊脂、麥康凱瓊脂 北京陸橋技術(shù)股份責(zé)任公司；XLT4培養(yǎng)基及其補(bǔ)充液 美國BD公司。

1.1.3 抗生素

藥敏性測定用抗生素：萘啶酮酸（nalidixic acid，NAL）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、阿米卡星（amikacin，AMK）、硫酸慶大霉素（gentamicin，GEN）、鏈霉素（streptomycin，STR）、卡那霉素（kanamycin，KAN）、頭孢曲松（ceftriaxone，CRO）、頭孢西?。╟efoxitin，F(xiàn)OX）、頭孢噻呋（ceftiofur，TIO）、頭孢哌酮（cefoperazone，PER）、氨芐西林（ampicillin，AMP）、阿莫西林/克拉維酸（amoxicillin-clavulanic acid，AMC）、氯霉素（chloramphenicol，CHL）、四環(huán)素（tetracycline，TET）、復(fù)方新諾明（trimethoprim/sulfamethoxazole，SXT）和多黏菌素B（polymyxin B，PB）（均為分析純） 美國Sigma公司。

1.1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物

ESBLs編碼基因（blaTEM、blaCTX-M、blaOXA、blaACC和blaPSE）和質(zhì)粒介導(dǎo)的（氟）喹諾酮耐藥相關(guān)基因（qnrA、qnrB、qnrS、acc(6’)-Ib和qepA）擴(kuò)增引物，IncN和IncI1不相容群質(zhì)粒PCR復(fù)制子分型用引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.1.5 試劑

1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）、5×TBE緩沖液、瓊脂糖凝膠、dNTP、PCR buffer、MgCl2、rTaqTM DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mycycler PCR儀、DNA電泳和凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；Milli-Q純水儀 法國Millpore公司；磁力加熱攪拌器 美國Fisher公司；微波爐 廣州美的微波爐制造有限公司；-40 ℃低溫冰箱、-80 ℃低溫冰箱日本Sanyo公司；百分之一天平、萬分之一天平 德國賽多利斯公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安高壓儀器設(shè)備有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；移液器、高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；生物安全柜 美國Labgard公司；超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；濁度儀 美國DADE Behring公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 北京科偉試驗(yàn)儀器有限公司；恒溫?fù)u床 上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 IncI1和IncN質(zhì)粒分型

基于PCR復(fù)制子分型方法對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行不相容群分析，用單一PCR法篩選攜帶IncI1和IncN不相容群質(zhì)粒的菌株。采用煮沸法制備DNA模板。PCR條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，相應(yīng)退火溫度條件下1 min、72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。退火溫度由相應(yīng)基因的引物序列決定。2 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳和溴化乙錠染色后于凝膠成像系統(tǒng)下檢測。在低溫條件下將PCR粗產(chǎn)物送至上海桑尼生物科技有限公司測序，采用在線比對(duì)軟件BLAST進(jìn)行比對(duì)，確定質(zhì)粒類型。

1.3.2 藥敏性測定

采用美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institution，CLSI推薦使用的瓊脂稀釋法，測定供試抗生素對(duì)沙門氏菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentrations，MIC），參考CLSI的標(biāo)準(zhǔn)解讀藥敏性測定結(jié)果。

1.3.3 耐藥基因檢測

采用普通PCR檢測相關(guān)耐藥基因，引物如表2所示，PCR模板（菌株總DNA）、擴(kuò)增體系和具體條件

1.3.1節(jié)所示。

1.3.4 質(zhì)粒膜接合實(shí)驗(yàn)

基于IncI1和IncN質(zhì)粒陽性菌株及受體菌藥敏性結(jié)果，選擇分別攜帶IncI1質(zhì)粒和IncN質(zhì)粒的沙門氏菌作為供體菌，不含該2 種質(zhì)粒的大腸桿菌和沙門氏菌為受體菌，采用膜過濾法進(jìn)行接合。接合方法如下：取OD600 nm為0.6的供體菌和受體菌菌液各1 mL于5 mL LB肉湯中混勻，轉(zhuǎn)入孔徑0.22 μm的濾器過濾，過濾后將濾膜緊貼于不含抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基表面，有菌的一面向上，37 ℃過夜培養(yǎng)。用5 mL LB肉湯清洗過夜培養(yǎng)的濾膜，梯度稀釋后分別涂布于同時(shí)含有CRO（32 μg/mL）和CIP（16 μg/mL）或同時(shí)含有STR（64 μg/mL）和CIP（16 μg/mL）的LB平板上，雙抗平板的選擇根據(jù)供體菌和受體菌的耐藥表型確定，每個(gè)梯度3 個(gè)平行，37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)。

將OD600 nm為0.6的受體菌梯度稀釋后均勻涂布于不含抗生素的LB平板，每個(gè)梯度3 個(gè)平行，37 ℃培養(yǎng)過夜，計(jì)數(shù)，用于菌液起始濃度的確定。同時(shí)，將供體菌和受體菌分別涂布于相應(yīng)的雙抗平板上，每株菌3 個(gè)平行，37 ℃培養(yǎng)48 h，作為對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后，確定供體菌和受體菌不能在相應(yīng)的雙抗平板上生長時(shí)，再在涂布有不同稀釋度接合子的雙抗平板上隨機(jī)挑選10 個(gè)單菌落，以表2中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳和測序分析，確定IncI1和IncN質(zhì)粒在接合過程發(fā)生了水平轉(zhuǎn)移。接合子攜帶的耐藥基因和藥敏性檢測方法同1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)。接合頻率計(jì)算公式如下：

式中：T為陽性接合子平均菌落數(shù)；R為受體菌平均菌落數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Minitab®18.1對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用χ2檢驗(yàn)比較不同條件下的檢出率，P＜0.05，差異顯著。

相關(guān)鏈接：沙門氏菌，β-內(nèi)酰胺酶，抗生素，硫酸慶大霉素，環(huán)丙沙星，多黏菌素B，菌株，偉業(yè)計(jì)量

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