微生物的生長繁殖和代謝是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的重要因素。細(xì)菌群體感應(yīng)（QuorumSenSIng，QS）是一種依賴于細(xì)胞密度的信息交流方式，以自誘導(dǎo)物（AuToInducerS，AIS）為群體感應(yīng)信號分子，它通過調(diào)控食品中優(yōu)勢腐敗菌的生長代謝來調(diào)控食品腐敗進(jìn)程。研究表明，群體感應(yīng)抑制劑可通過與AIS受體蛋白結(jié)合，降解AIS分子和阻斷群體感應(yīng)通路等途徑有效干擾細(xì)菌群體感應(yīng)的表達(dá)，降低食源性細(xì)菌的致病性或致腐性。利用群體感應(yīng)抑制劑靶向調(diào)控細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)來抑制食品腐敗，已成為食品保鮮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

近年來，研究學(xué)者在水果、蔬菜和中草藥等天然植物的提取物中篩選到很多安全、有效的活性成分，這些物質(zhì)作為群體感應(yīng)抑制劑可有效降低微生物的毒性。大蒜提取物是具有群體感應(yīng)抑制活性的物質(zhì)，能在亞抑菌濃度下阻斷N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLS）信號分子介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)，抑制其毒力因子產(chǎn)生，然而，目前關(guān)于大蒜提取物對腐敗菌腐敗能力的干擾作用仍少有報(bào)道。

本試驗(yàn)以在發(fā)酵魚糜中篩選到的腐敗菌維氏氣單胞菌為對象，分析其AHLS介導(dǎo)的群體感應(yīng)現(xiàn)象，探究大蒜提取物對該細(xì)菌產(chǎn)AHLS活性、生物膜形成能力、毒力基因表達(dá)和致腐能力的干擾作用，以期利用大蒜提取物等群體感應(yīng)抑制劑作為食品保鮮劑，提高食品的安全性和貨架期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：新鮮大蒜，購于杭州市潮王路菜市場；魚糜，A級海產(chǎn)銅盆魚糜，由上虞市傣之味食品有限公司提供，貯藏于-18℃冰箱中，備用。菌種：維氏氣單胞菌，分離于發(fā)酵魚糜，添加20%甘油，保存于本實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱中。根癌農(nóng)桿菌[AgrobActeriumtumefAeiensA136（PcF218/PcF372）]，壯觀霉素抗性，用量為50μg/mL。

試劑：甲酸、乙酸乙酯、二甲基亞砜（DmSO）、甲苯為分析純級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、結(jié)晶紫、吖啶橙、壯觀霉素、細(xì)菌基因組DnA快速抽提試劑盒、細(xì)菌總RnA快速抽提試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；RP-c18F254S反相薄層層析板，德國merck公司；AHLS標(biāo)準(zhǔn)品，美國SIgma公司。
1.2儀器與設(shè)備

SPecTramaxm5酶標(biāo)儀，美國molecularDevIceS公司；LIFeEcoPcR儀，杭州博日科技有限公司；FV300激光共聚焦顯微鏡，日本OLYmPUS公司；STePOne型熒光定量PcR儀，美國ABI公司；PHS-3c型數(shù)顯酸度計(jì)，上海精科儀器有限公司；K9840自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；e2695型高效液相色譜儀，美國WaTerS公司；YXQ-LS-SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌產(chǎn)AHLS分子檢測

參照Ravn等的方法，采用生物報(bào)告菌法分析細(xì)菌產(chǎn)AHLS分子的活性和種類。

采用平行劃線法分析AHLS的產(chǎn)生情況，在含1%瓊脂的LB平板上涂布40μLX-gal（20mg/mL），將活化12h的根癌農(nóng)桿菌與待測菌平行劃線，于30℃中培養(yǎng)24h，觀察根癌農(nóng)桿菌的顏色變化。

將待測菌培養(yǎng)液離心（8000×g，5mIn，4℃），上清液用等量酸化乙酸乙酯（0.5%甲酸）提取2～3次，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，用DmSO重新溶解，于-20℃保存待用。

采用平板擴(kuò)散法分析AHLS活性變化，100mL含1%瓊脂的LB培養(yǎng)基中加入4～10mL活化的根癌農(nóng)桿菌和500μLX-gal（20mg/mL），混合均勻后傾注平板，待冷卻凝固后打孔，加入40μL待測菌AHLS提取液，于30℃中培養(yǎng)36～48h，觀察平板的顏色變化。

采用薄層色譜法（TLc）分析細(xì)菌產(chǎn)生AHLS種類，取1～10μLAHLS標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌AHLS提取物樣品，點(diǎn)樣于c18反相薄層層析板。用層析液甲醇-水（體積比60/40）充分展開，取出后在常溫下?lián)]干溶劑。制備含根癌農(nóng)桿菌的固體培養(yǎng)基，傾于板上，凝固后在30℃無菌密閉容器中培養(yǎng)36～48h，觀察顏色變化。AHLS標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為：0.1mmol/LN-丁?；?高絲氨酸內(nèi)酯（c4-HSL）、10μmol/LN-己酰基-高絲氨酸內(nèi)酯（c6-HSL）、0.04μmol/LN-庚酰基-高絲氨酸內(nèi)酯（c7-HSL）、0.06μmol/LN-辛?；?高絲氨酸內(nèi)酯（c8-HSL）、0.8nmol/L3-氧代-己?；?高絲氨酸內(nèi)酯（oxo-c6-HSL）和1.6nmol/L3-氧代-辛?；?高絲氨酸內(nèi)酯（oxo-c8-HSL）。

1.3.2 細(xì)菌的生長曲線及培養(yǎng)液PH值的測定

將活化12h的待測菌接種到100mLLB液體培養(yǎng)基中，在30℃下?lián)u床培養(yǎng)24h，間隔一定時(shí)間取樣，參照GB/T4789.2-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》計(jì)數(shù)，同時(shí)利用酸度計(jì)測定培養(yǎng)液PH值的變化。

1.3.3 基因分析

采用PcR技術(shù)分析細(xì)菌的luxRI同源基因、鳥氨酸脫羧酶基因（ODC）、賴氨酸脫羧酶基因（LDC）、鞭毛基因（flA）、彈性蛋白酶（AhyB）、絲氨酸蛋白酶基因（ser）、脂肪酶基因（liP）。將細(xì)菌過夜活化，利用細(xì)菌DnA提取試劑盒提取細(xì)菌DnA模板，使用的引物見表1。50μL反應(yīng)體系，PcR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃3mIn，變性95℃30S，退火55℃1mIn，延伸72℃1mIn（35個(gè)循環(huán)），終延伸72℃10mIn。其中，擴(kuò)增AhyB和flA基因時(shí)退火溫度為59℃。將擴(kuò)增到的基因片段進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下成像，同時(shí)送往生工生物工程有限公司測序。將得到的序列進(jìn)行BLAST搜索和同源性分析。

1.3.4 大蒜提取物的制備

參照RaSmuSSen等的方法制備大蒜提取物。將市售大蒜去皮，稱取150g于300mL甲苯中勻漿，萃取12h后用WhaTman1號濾紙過濾。向?yàn)V液中加入150mL無菌水，在室溫條件下攪拌24h，兩相分離得水相，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后得1g/mL大蒜提取物。通過二倍稀釋法確定大蒜提取物對待測菌的最小抑菌濃度。

1.3.5 β-半乳糖酶活性的測定

將待測菌過夜活化12h，取500μL細(xì)菌培養(yǎng)液接種至100mLLB液體培養(yǎng)基中，分別加入1mL不同質(zhì)量濃度的大蒜提取物（終質(zhì)量濃度為0.15～1.20mg/mL），以無菌生理鹽水為對照，于30℃搖床中振蕩培養(yǎng)12h，將培養(yǎng)液離心（8000×g，10mIn）得上清液。參照mIller的方法測定生物報(bào)告菌的β-半乳糖酶活性。

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