2.6協(xié)作驗證結果

EAEC標準物質通過3家協(xié)作驗證實驗室的標定，測定結果如表7所示，EAEC菌體標準樣品菌含量均為103CFU/樣品，與研制的目標值一致。生化和特征基因PCR鑒定結果符合EAEC的特征。同時EAECgDNA標準物質特征基因PCR鑒定結果也符合實驗要求。

2.7標準物質使用效果驗證

選擇熟肉制品、乳粉、腐乳、餅干和薯片5種食品基質共20份樣品對EAEC標準物質的使用效果進行驗證，檢驗結果顯示，20件樣品正常檢驗（作為本底對照）分離平板上未見可疑菌落，而加入標準物質的樣品在分離平板上均有可疑菌落生長，并通過PCR檢測擴增得到相應的特征基因條帶，與gDNA標準物質擴增條帶大小一致。結果表明，研制的標準物質和基因組標準物質適用于食品中腸道集聚性大腸埃希氏菌檢驗的質控需求。

3討論和結論

準確快速的檢測技術是及時有效控制和預防由病原菌引起的食源性疾病的重要手段。目前食品和腹瀉病人中致瀉大腸埃希氏菌的檢測越來越受到關注和重視。由于致瀉大腸埃希氏菌種類繁多的血清群/型，給檢驗工作帶來很多挑戰(zhàn)?？焖贉蚀_的檢驗工作不僅依賴于不同技術的檢驗方法，還需要科學使用標準物質來保證實驗結果的準確性。目前，國內(nèi)針對微生物標準物質的研制已有較大的發(fā)展，標準菌株多來自美國菌種保藏中心（ATCC），而且對于標準菌株的鑒定方式多為傳統(tǒng)的生化反應。目前對于具有我國自主知識產(chǎn)權而且具有清晰全基因組序列信息的標準物質研究還是空白。本研究采用的EAEC標準菌株來源于中國醫(yī)學細菌保藏管理中心（CMCC），分離自我國腹瀉病人，具有我國自主知識產(chǎn)權。

全基因組測序技術在微生物領域研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。隨著測序技術所獲得數(shù)據(jù)量的突破性進展，測序速度和費用得到大幅度改觀。而且二代測序數(shù)據(jù)分析軟件的日趨完善，非生物信息學專業(yè)人員可以使用網(wǎng)頁類型分析工具對微生物基因組測序數(shù)據(jù)完成微生物遺傳特征、溯源等信息分析。RapidAnnotationusingSubsystemTechnology(RAST，http://rast.nmpdr.org)能夠快速注釋基因組信息、CenterforGenomicEpidemiology(CGE，https://cge.cbs.dtu.dk/)網(wǎng)站擁有方便快捷的獨立數(shù)據(jù)分析工具，可以進行種屬鑒定、耐藥基因、毒力因子、質粒分型以及菌株分子分型等特征分析。這些網(wǎng)頁類型分析工具可提供更為直觀的用戶界面和簡便的操作環(huán)境。本研究利用RAST、PATRIC、CGE對EAEC進行了種屬鑒定、血清分型和除astA、aggR、pic特征基因之外的毒力基因分析，為標準物質的研制奠定了科學準確的基礎。

本研究根據(jù)國家標準GB4789.6中的引物序列對EAEC標準物質進行了特征性基因擴增。實驗結果顯示，astA、aggR和pic基因得到清晰的擴增條帶，說明PCR擴增結果和全基因組測序數(shù)據(jù)結果準確對應。在傳統(tǒng)的生化方法基礎上，利用PCR技術對毒力基因進行擴增，是提高EAEC檢出率的有力手段，同時也為標準物質的檢驗提供了快速準確的方法。

目前研究中報道的相關標準物質包括DNA標準物質是以粉末形式凍干，本研究制備的EAEC菌體標準物質和gDNA標準物質均以小球的形式進行凍干，相比較粉末形式凍干，該標準物質使用避免了由于粉末開蓋帶來的污染和質粒污染，并且省去離心步驟，操作更加方便，同時該標準物質易于溶解，計數(shù)更準確。

本研究制備的EAEC菌體標準物質均勻性良好，經(jīng)單因素方差分析符合標準物質的要求。經(jīng)過25℃、37℃運輸穩(wěn)定性測試，7天仍能保持樣品中菌含量在103CFU/樣品水平，可以保證樣品在非極端的高溫天氣下運輸不受影響，而且在-20℃條件下可以長期儲存。對于EAECgDNA標準物質，同樣具有很好的穩(wěn)定性?？紤]到食品基質的復雜性，本研究選用5種不同的食品基質對標準物質進行了驗證，結果顯示加入標準物質的樣品均能檢測到EAEC，說明研制的菌體標準物質和gDNA標準物質適用于食品中EAEC的檢驗，滿足質控要求。

綜上所述，EAEC是造成人體中重度腹瀉的重要病原菌之一，開展食品中EAEC檢測工作對維護人類健康意義重大。本研究研制的具有自主知識產(chǎn)權和全基因組數(shù)據(jù)的EAEC菌體標準物質和gDNA標準物質均勻性和穩(wěn)定性良好，為EAEC的檢驗工作提供了有效參考，保證檢測結果的準確性，有利于保證食品質量與安全。該標準物質可用于實驗室質量控制及實驗室間比對，保證我國食品安全質量檢測數(shù)據(jù)的可靠、可與國際互認。

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