2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA的提取

利用NanoDrop2000對提取的CMCC44841基因組DNA進(jìn)行了純度測定，A260/280和A260/230分別為1.70和2.37。利用qubit熒光計對提取的EAECDNA測定了濃度為65ng/µL，提取的DNA能夠滿足后續(xù)全基因組測序和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的實驗要求。

2.2全基因組測序分析結(jié)果

本研究利用二代高通量全基因組測序技術(shù)對CMCC44841進(jìn)行了序列測定。獲得的基因組序列信息結(jié)果通過生物信息學(xué)分析，CMCC44841基因組大小為5.057285Mb，其N50重疊大小為114319bp，共121個長度從305600bp到505bp不等的contigs，GC含量為50.6%，編碼區(qū)基因5173個。利用CGE網(wǎng)站KmerFinder對細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定，結(jié)果顯示CMCC44841鑒定為大腸埃希氏菌（Escherichiacoli），具體鑒定結(jié)果如表2所示。同時利用CGE網(wǎng)站進(jìn)行血清預(yù)測、多位點序列分型（MLST）和毒力基因分析，CMCC44841血清預(yù)測結(jié)果為O127：H21，MLST為ST40型，攜帶毒力基因除aggR、astA、pic之外，還預(yù)測到含有aap、aar、afaD、agg3C、lpfA、ompT等毒力基因，詳見表3。CMCC44841全基因組測序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，序列號為SRR12278211。

2.3特征性基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

按照GB4789.6-2016的方法對CMCC44841分別進(jìn)行了astA、aggR、pic特征性基因檢測。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示提取的CMCC44841DNA分別擴(kuò)增出102bp、400bp和1111bp長度片段。不同濃度DNA擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，0.1、0.01、0.001ng/µl的DNA均有特征性基因擴(kuò)增產(chǎn)物，選擇CMCC44841DNA凍干小球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用時PCR的模板量≥0.1ng/µl，按照20ng/球進(jìn)行DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備。

2.4標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗結(jié)果

隨機(jī)抽取的20瓶EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)平板計數(shù)結(jié)果如表4所示。所有樣品菌落數(shù)均在103CFU數(shù)量級，數(shù)值符合正態(tài)分布。SPSS軟件單因子方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)=1.59＜F臨界值=2.137，P＞0.05。表明在顯著水平為0.05時，本次所制備的EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組內(nèi)和組間無顯著性差異，即樣品符合均勻性要求。

隨機(jī)抽取10瓶EAECgDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，10個gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的astA、aggR、pic基因均得到清晰的擴(kuò)增條帶（圖2）。

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