自1908年發(fā)現(xiàn)煙草青枯病這種典型的維管束病害以來，國內(nèi)外許多學(xué)者致力于煙草青枯病的防治研究，并獲得多種防治方法，其中主要包括化學(xué)防治(陳澤棚等,2011)、選育抗病煙草(Nicotianatabacum)品種防治(方樹民等,2001)、通過耕作制度管理防治(萬川等,2015)和生物防治等。我國針對煙草青枯病的生物防治研究起步較晚，需要加大研究力度以解決煙草種植業(yè)中面臨的問題。煙草青枯病的生物防治方法主要有無致病力(avirulent-strains)青枯病原菌(Ralstoniasolanacearum)的應(yīng)用(謝銳鴻等,2014；肖田等,2008；肖田等,2015)和拮抗煙草青枯病原菌的應(yīng)用，以及利用其他植物的提取物進行防治等(鄧正平等,2003；陳啟建等,2004；劉學(xué)端,肖啟明,1997；賴榮泉等,2011)。目前已有報道的拮抗煙草青枯病原菌的微生物主要種類為細菌中的芽胞桿菌屬(Bacillus)(何玉安等,2018；張欣悅等,2020；劉艷霞等,2020)和假單胞菌屬(Pseudo-monas)(胡軍華等,2009；董夏偉等,2011)，其他種類的微生物相對較少。已有的研究表明，拮抗煙草青枯病原菌的放線菌類微生物主要是鏈霉菌(Strepto-myces)(羅文建等,2017；張薇,2009)。施用添加拮抗菌的有機肥對控制煙草青枯病和提高產(chǎn)量具有良好的效果(張欣悅等,2020；張明宇等,2020)。本研究針對四川省煙草主栽區(qū)，從涼山州和瀘州市的煙草根際土壤中共分離獲得3株拮抗煙草青枯病原菌的放線菌，并對其進行鑒定，以期加速煙草青枯病原菌拮抗菌應(yīng)用于生物有機肥的進程，為生物有機肥研制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試病原菌

煙草(Nicotianatabacum)青枯病原菌(Ralstoniasolanacearum)，由云南省煙草科學(xué)研究院惠贈。煙草猝倒病原菌-瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、煙草黑脛病原菌-寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)和煙草赤星病原菌-鏈格孢(Alternariaalternata)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)區(qū)劃與農(nóng)業(yè)資源研究所惠贈。辣椒(Capsicumannuum)青枯病原菌ZT3721由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院惠贈。番茄(Solanumlycopersicum)青枯病原菌GIM1.70和馬鈴薯(Solanumtuberosum)青枯病原菌GIM1.74購買自廣東微生物菌種保藏中心。

1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)液：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10.0g，pH7.4。TM培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，葡萄糖5.0g，酪素水解物(trypticase)1.0g，瓊脂粉18.0g。

1.3拮抗菌的篩選

結(jié)合噴霧法和雙層平板法初步篩選拮抗菌株(王羽,肖崇剛,2004；趙斌,何紹江,2002；Sooheeetal,2008)，復(fù)篩時將初篩所得菌株接入LB培養(yǎng)液中進行液體發(fā)酵，發(fā)酵液與煙草青枯病原菌進行平板對峙實驗(吳翔等,2019)，在TM培養(yǎng)基中涂布病原菌的菌液，再用直徑6mm的打孔器在培養(yǎng)皿中央打1個孔，在孔中接入20μL初篩拮抗菌的發(fā)酵液，記錄孔周圍的抑菌圈直徑。抑菌圈直徑反映各菌株對病原菌的抑制能力。

1.4拮抗菌抑菌譜測定

分別測定拮抗菌固體菌體和發(fā)酵液對待測病原菌的拮抗能力，測定方法為平板對峙法。用直徑為6mm的打孔器先在盛有TM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央打1個孔，然后在距離平板中心相等的3個方向分別打孔。從完成培養(yǎng)的病原菌平皿中打孔獲得同樣大小菌餅，置于空白培養(yǎng)基的中央孔，四周孔分別接入拮抗菌菌餅和發(fā)酵液，于28℃正置培養(yǎng)，觀測抑菌情況。

1.5菌株鑒定

1.5.1形態(tài)特征分析

顯微形態(tài)特征分析：放線菌的菌絲和孢子形態(tài)用高氏一號培養(yǎng)基(趙斌,何紹江,2002)埋片培養(yǎng)。將瓊脂平板挖長方形小穴，于穴邊緣接種篩選出的菌株，蓋上無菌蓋玻片，適當(dāng)溫度下培養(yǎng)，菌體長在蓋片上。第5天取出蓋片，風(fēng)干樣品，鍍膜后在JSM7500F型掃描電鏡(JEOL,日本)下觀察超微結(jié)構(gòu)。

培養(yǎng)形態(tài)特征分析：參照有關(guān)放線菌培養(yǎng)特征所采用的標準培養(yǎng)基進行實驗(Shirlingetal,1966)。選用以下8種培養(yǎng)基：察氏瓊脂、葡萄糖-天門冬酰胺瓊脂、麥芽膏-酵母膏瓊脂、馬鈴薯浸汁瓊脂、燕麥片瓊脂、無機鹽淀粉瓊脂、甘油-天門冬酰胺瓊脂、營養(yǎng)瓊脂，分別在平板劃線接種3株放線菌，30℃培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第3和5天，觀測氣生菌絲和基內(nèi)菌絲的顏色及其生長情況，觀察并記錄是否產(chǎn)生可溶性色素及其顏色。將放線菌劃線接種于高氏一號培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱適溫、適時培養(yǎng)，對菌落形態(tài)拍照。

1.5.2生理生化特征分析

生長的pH范圍：將高氏一號培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為5、6、7、8、9、10、11，將待測菌株接入培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)，觀測菌株的生長情況，確定最適pH值及范圍。生長溫度實驗：將放線菌接入高氏一號培養(yǎng)基，分別于7、15、25、30、40、45、50和55℃培養(yǎng)，于第3天和第7天觀察菌株的生長狀況，確定各菌株的最適生長溫度及范圍。NaCl耐受實驗：分別在高氏一號培養(yǎng)基中添加1%、4%、8%和10%(W/V)NaCl，將菌株接入培養(yǎng)基，檢測各菌株對NaCl的耐受性。其他生理生化檢測參照《微生物學(xué)實驗》(趙斌,何紹江,2002)進行操作。

1.5.3總DNA提取與PCR擴增

采用杭州博日科技有限公司的試劑盒進行待測菌株基因組DNA提取。用細菌通用引物對(正向引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT3')擴增菌株16SrRNA基因；以獲得的DNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(吳翔等,2019)。由上海生工生物工程有限公司合成引物并對PCR產(chǎn)物測序。將測得的16SrRNA基因序列提交GenBank,獲得各菌株的核酸登錄號。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌株篩選

采用噴霧法和雙層平板法初篩拮抗菌株，以能產(chǎn)生明顯的拮抗圈為特征進行篩選，初步篩選出對煙草青枯病原菌具有拮抗作用的放線菌6株(圖1A)。利用平板對峙法再從初篩的菌株中復(fù)篩，結(jié)果顯示，其中3株放線菌(SC-105-B-10,L2-003-A-5,SC-168-A-2)的發(fā)酵液在培養(yǎng)基上的抑菌圈明顯，抑菌圈直徑分別為30.67、17.03和30.33mm(圖1B)。

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