荷葉屬睡蓮科植物蓮的葉片，是國(guó)家衛(wèi)生部公布的既是食品又是藥品的植物。荷葉中富含多種具有生物活性的成分，如荷葉精油、荷葉生物堿、荷葉多糖及荷葉黃酮等，其中荷葉黃酮是其主要活性物質(zhì)。報(bào)道顯示，黃酮類化合物對(duì)治療血管病有很好的效果，具有抗氧化、穩(wěn)固血管、疏通血管、防止高齡人的血壓疾病等功效，對(duì)身體代謝和人體免疫也有重要作用。所以，針對(duì)影響荷葉總黃酮提取的因素進(jìn)行研究，選擇優(yōu)良的提取工藝，提高荷葉總黃酮的提取率，研究其總黃酮抗氧化性，對(duì)人體健康保護(hù)具有重要意義。

1.實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

荷葉樣品，河北衡水湖；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、H2O2、水楊酸，均為分析純；蘆丁對(duì)照品，含量98.7%，化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品，上海金穗生物科技有限公司。722型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；FA2004B型電子天平，上海衡平儀器儀表廠；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；80-2型高速離心機(jī)，金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；BL6-180A型超聲波清洗機(jī)，上海碧浪儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵，鄭州長(zhǎng)盛實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GZH-DH-X型電熱恒溫干燥箱，鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司。

1.2薄荷葉總黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)

將風(fēng)干的荷葉置于干燥的粉碎機(jī)，粉碎4min后，過(guò)60目分樣篩，得到所需荷葉樣品，儲(chǔ)存于密封容器中，待用。

荷葉中總黃酮的提取流程：預(yù)處理后的荷葉粉→加入乙醇→超聲提取→冷卻至室溫→離心→收集上清液→測(cè)吸光度→計(jì)算黃酮含量。

1.2.1料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)備75%乙醇溶液，電子天平稱量1.00g處理備用的荷葉粉末，依據(jù)料液比1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14分別混合，實(shí)驗(yàn)時(shí)間25min，溫度45℃，進(jìn)行總黃酮提取。然后將得到的提取液離心分離15min（轉(zhuǎn)速5000r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25mL，取1mL清液進(jìn)行黃酮含量測(cè)定。

1.2.2實(shí)驗(yàn)溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)備75%乙醇溶液，用電子天平稱量1.00g處理備用的荷葉粉末，依據(jù)料液比1∶10混合，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為25min，分別在溫度為25℃、35℃、45℃、55℃和65℃的實(shí)驗(yàn)條件下提取總黃酮。然后將得到的提取液離心分離15min（轉(zhuǎn)速為5000r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25mL，取1.00mL清液進(jìn)行黃酮含量測(cè)定。

1.2.3不同乙醇濃度對(duì)提取總黃酮提取率的影響

用電子天平稱量1.00g處理備用的荷葉粉末，依據(jù)料液比1∶10，加入不同濃度（45%、55%、65%、75%、85%）的乙醇，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為25min，溫度45℃，進(jìn)行總黃酮提取。然后將得到提取液離心分離15min（轉(zhuǎn)速為5000r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25mL，取1.00mL清液進(jìn)行黃酮含量測(cè)定。

1.2.4超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)備75%乙醇溶液，用電子天平稱量1.00g處理備用的荷葉粉末，依據(jù)料液比1∶10混合，超聲溫度45℃，超聲提取時(shí)間分別為15min、30min、45min、60min、75min。然后將得到提取液離心分離15min（轉(zhuǎn)速為5000r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25mL，取1.00mL清液進(jìn)行黃酮含量測(cè)定。

1.3正交實(shí)驗(yàn)

綜合以上的單因素實(shí)驗(yàn)再次進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以確定提取荷葉總黃酮的最佳實(shí)驗(yàn)方案。正交因素水平表見(jiàn)表1。

1.4總黃酮含量測(cè)定

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將10mg蘆丁溶于75%乙醇中，小幅度地?fù)u晃，靜置后使用蒸餾水定容至10mL，得到濃度為1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL蘆丁溶液放入20mL比色管中，量取1.0mL濃度為5%NaNO₂溶液，加入試管，搖勻后靜置8min；量取1.0mL濃度為10%的Al（NO₃）₃溶液，加入比色管，輕晃后放置8min；量取10.0mL濃度為5%的氫氧化鈉溶液，加入比色管；向比色管中加入75%的乙醇至20mL，輕晃，靜置18min。510nm處測(cè)定各溶液的吸光度，做出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2黃酮含量的計(jì)算

準(zhǔn)確量1.2所得的清液1.0mL，按以上步驟在510nm的位置檢測(cè)其吸光度值。依照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出對(duì)應(yīng)的黃酮濃度，依照公式計(jì)算黃酮含量。

黃酮含量（g/100g）=a×c×V/10W

（c，V，W為實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)）

式中：a-稀釋倍數(shù)；c-黃酮濃度，mg/mL；V-提取液總體積，mL；W-甘草粉質(zhì)量，g。

1.5荷葉總黃酮的抗氧化性

1.5.1對(duì)DPPH自由基的清除能力

（1）配制所需濃度的DPPH溶液

用95%乙醇溶液對(duì)0.0112g的DPPH進(jìn)行溶解；將上述溶液加入到50mL容量瓶中，加入95%乙醇溶液定容。

（2）測(cè)試DPPH自由基本身的吸光值A(chǔ)c

取配好的DPPH溶液2.00mL于試管中；移取2.00mL的蒸餾水加入比色管，定容，輕晃，陰暗處?kù)o置18min；測(cè)定溶液在510nm位置的吸光值A(chǔ)c。測(cè)試3次，取均值。

（3）測(cè)定加入黃酮后溶液的吸光值A(chǔ)_i

將不同濃度的樣品溶液2.00mL用移液管移至試管中；取配好的DPPH溶液2.00mL，加入比色管，定容，輕晃，背光處放置18min；測(cè)定510nm處的吸光值A(chǔ)_i。重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值。

（4）測(cè)試黃酮本身的吸光值A(chǔ)_j

分別將不同濃度的樣品溶液用移液管移取2.0mL至不同試管中；量取2.0mL蒸餾水放入比色管，定容，輕晃，陰暗處放置18min；測(cè)定510nm處的吸光值A(chǔ)_j。重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值。相同步驟測(cè)定相同濃度VC標(biāo)準(zhǔn)液的清除能力為對(duì)照。

（5）計(jì)算DPPH·清除率：

1.5.2對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用

1.5.2.1測(cè)試羥自由基本身的吸光值D

（1）量取2.00mL蒸餾水放入比色管。

（2）量取2.00mL濃度為6mmol/L的FeSO₄溶液，加入比色管后搖勻，放置15min。

（3）量取2.00mL濃度為6mmol/L的水楊酸，加入比色管后搖勻，放置15min。

（4）量取2.00mLH₂O₂溶液，加入比色管搖勻，放置15min。

（5）測(cè)出溶液在510nm下的吸光度值，記為D。

量取2.00mL蒸餾水放入比色管，測(cè)定將荷葉黃酮提取液加入到羥自由基后溶液的吸光值D_i，量取2.00mL濃度為6mmol/L的FeSO₄溶液，加入比色管后搖勻，放置15min，量取2.00mL濃度為6mmol/L的水楊酸，加入比色管后搖勻，放置15min，量取2.00mLH₂O₂溶液，加入比色管搖勻，放置15min，測(cè)出溶液在510nm下的吸光度值，記為D。

1.5.2.3測(cè)試不同濃度荷葉提取液本身的吸光值D_j

1.5.2.4相同步驟配制相同濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)液為對(duì)照

1.5.2.5計(jì)算羥自由基的清除率

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