真菌色素是天然色素的重要來源，具有獨(dú)特的生產(chǎn)優(yōu)勢和生物活性，主要有紅、黃、藍(lán)三大色系。相對于紅色色素，真菌黃色色素的種類較少，但在食品、化妝品等方面具有廣闊的市場前景。目前已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃色色素的真菌主要有(1)紅曲霉屬(Monascusspp)產(chǎn)生萘醌類紅曲黃色素，并已商業(yè)化生產(chǎn)；(2)曲霉屬(Aspergillus)A．cristatus和A．xavus產(chǎn)生羥基蒽醌類黃色素；(3)青霉屬Penicilliumcitreonigrum產(chǎn)生黃色素；(4)散囊菌屬Eurotiumrubrum分泌蒽醌類棕黃色色素。而Simplicillium屬真菌產(chǎn)生的色素則未見報道。

本實驗室從藍(lán)藻培養(yǎng)液中分離出一株共生真菌Simpliciiliumlanosoniveum(DT06)。該真菌在沙氏培養(yǎng)基中合成一種新的抗生素、胞外多糖和微量的色素，而在含碳無機(jī)培養(yǎng)基中則大量合成黃色素(DT06色素)，這也是首次發(fā)現(xiàn)Simplicillium屬的真菌能夠合成色素。本文對DT06色素進(jìn)行分離純化、表征，研究其抗氧化性和穩(wěn)定性，并采用Plackett—Burman和響應(yīng)面設(shè)計，對其發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，為該色素的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1、材料

（1）菌種與培養(yǎng)基

真菌DT06(Simplicilliumlanosoniveum)由河北工業(yè)大學(xué)代謝工程實驗室分離，現(xiàn)保藏在中國科學(xué)院微生物研究所菌物標(biāo)本館，保藏編號HMAS242045。PDA培養(yǎng)基(1L)：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，pH自然。

改良BG-11培養(yǎng)基(1L)：NaNO₃0.76g，K₂HP0₄0.48g，MgS0₄·7H₂0O.075g，CaCl₂·2H₂00.036g，葡萄糖18g，Criticacidstock(CS)10mL，Tracemetalmix(TM)lmL，pH自然。

（2）材料、儀器與設(shè)備

2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：南京奧多福尼生物科技有限公司；其他分析純化學(xué)品均購自天津大學(xué)科威公司。

Agilent-1200高效液相色譜儀：美國Agilent公司；CARy300型紫外光譜分析儀：上海精科儀器廠；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

2、方法

（1）發(fā)酵方法

將4℃保藏的真菌DT06接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)5d，無菌條件下配制成孢子懸浮液，接種于100／250mLBG-11培養(yǎng)基中，在25℃、130r／min條件下?lián)u床培養(yǎng)36h制成種子液，以l％的接種量把種子液轉(zhuǎn)接到80／250mL改良BG-11培養(yǎng)基中，在相同條件下?lián)u床培養(yǎng)7d。

（2）色素的分離與純化

將發(fā)酵液在8000r／min條件下離心10min，除去菌絲體，收集上清液。500mL上清液中加入300mL鹽酸酸化的乙酸乙酯，充分震蕩，靜置取上層乙酸乙酯萃取液。濾液低壓蒸餾除去乙酸乙酯，得到的色素用甲醇溶解，再用0．22μm濾膜過濾，得到高純度甲醇色素溶液。

（3）色素的色譜分析及含量計算方法

將得到的高純度色素溶液用適量甲醇稀釋，用紫外-可見分光光度計進(jìn)行全波段掃描(200～800nm)，以確定最大吸收波長。

采用Agilent-1200高效液相色譜儀進(jìn)行分析，色譜條件：C18(Kromasil)色譜柱(250mm×4．6mm，5μm)；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：25℃，紫外-可見光檢測器。在上述條件下檢測DT06色素的最佳流動相及流速。

在色素的最大吸收波長下，用吸光度值表示色素含量，色素含量表示為最大吸收波長下每毫升澄清發(fā)酵液的吸光度值。

（4）色素的抗氧化活性

分別測定真菌DT06色素對DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基和羥基自由基的清除能力。DPPH自由基、ABTS自由基和超氧自由基的清除率計算公式為：[1-(A₁-A₂)／A₀]×100；羥基自由基清除率計算公式為：(A₁-A₀)／(A₂-A₀)×100，其中A₁、A₂和A₀分別為實驗組、對照組和空白組的吸光值。相同條件下，用等濃度的維生素C做陽性對照。

（5）色素的穩(wěn)定性

分別取一定量的色素溶液于具塞試管中，研究不同溫度(4、20、40、60、80、100℃)、光照(黑暗、光照、紫外、12000LX)、pH(2、4、6、8、10)對其穩(wěn)定性的影響，每24h取樣一次，用280nm處的吸光度值表示色素含量。

（6）培養(yǎng)基各組分的優(yōu)化

在BG-11培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman(PB)試驗設(shè)計，研究葡萄糖(X₁)、NaN0₃(X₂)、K₂HP0₄(X₃)、MgS0₄·7H₂0(X₄)、CaCl₂‘2H₂0(X₅)、CS(X₆)、TM(X₇)對真菌DT06生產(chǎn)色素(Y)的影響，在PB實驗設(shè)計結(jié)果的基礎(chǔ)上，用Box-Behnken設(shè)計(BBD)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

二、結(jié)果與討論

1、色素的色譜分析

酸化的乙酸乙酯萃取液經(jīng)減壓蒸餾、甲醇復(fù)溶得到高純度色素溶液，呈淺黃色(圖1)。DT06色素能溶于水，不同于A．cristatus產(chǎn)的黃色素。色素甲醇溶液的紫外可見掃描光譜如圖2a所示，在285nm處有特征吸收峰，與P．citreonigrum和E．rubrum黃色素分別在330nm和396nm處的特征吸收峰不同，285nm可以作為檢測波長用于高效液相色譜分析和色素含量測定。
 

根據(jù)色素的極性和色譜柱的性質(zhì)來選擇合適的流動相和流速，最終確定當(dāng)流動相為乙腈：水(2:8，V/V)、流速為0.8mL／min時色譜柱對色素的分離效果最好，如圖2b所示，在10.52min左右出現(xiàn)單一峰(7.84min為甲醇溶劑峰)，峰形陡峭、對稱性良好，表明色素純度較高。

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