2.2.2 響應(yīng)面分析及反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化

化根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)值鯊肝醇純度與3個因素的等高線及響應(yīng)面圖，見圖4～6。

通過對上述試驗(yàn)結(jié)果的分析，確定回歸模型預(yù)測的最佳反應(yīng)參數(shù)為：V_二氯甲烷：V_無水甲醇=9.17:0.83，上樣量3.11g，洗脫流速1.93mL/min，預(yù)測結(jié)果為18.08％。

2.2.3 驗(yàn)證檢驗(yàn)

為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，在以上最優(yōu)條件下做3次平行試驗(yàn)，結(jié)果見表4。試驗(yàn)組平均值與預(yù)測值相對誤差小于1％,說明通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的參數(shù)條件準(zhǔn)確可靠。

2.3 鯊肝醇制品組成分析

2.3.1 TLC結(jié)果

別對鯊肝醇與角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品、鯊魚肝油富集前、后樣品進(jìn)行點(diǎn)板顯色分析，結(jié)果如7所示。中性氧化鋁層析柱分離、純化鯊肝醇效果明顯，能將鯊魚肝油中鯊肝醇與角鯊烯分離。

2.3.2 組成成分分析

目前，市售的天然鯊肝醇產(chǎn)品主要指富含鯊肝醇的鯊魚肝油，一般純度在20％左右。本研究對影響中性氧化鋁層析柱分離、純化鯊肝醇作用效果的主要因素，即洗脫液比例、上樣量及洗脫流速進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)參數(shù)條件，使鯊肝醇純度達(dá)18.23％，此結(jié)果與市售鯊肝醇產(chǎn)品純度相差不大。圖8為鯊肝醇富集前、后的氣相色譜圖。鯊魚肝油不皂化物氣相檢測結(jié)果如圖8a所示，不皂化物中主要含有鯊肝醇與角鯊烯2種活性物質(zhì)，根據(jù)面積歸一法計(jì)算可得鯊肝醇含量為9.42％，角鯊烯含量為69.14％。

在洗脫液比例(V_二氯甲烷：V_無水甲醇)為9:1，上樣量3g及洗脫流速為2mL/min條件下，鯊肝醇經(jīng)中性氧化鋁層析柱分離純化后的氣相色譜分析結(jié)果如圖8所示，鯊肝醇含量有顯著提升。僅從譜圖看，鯊肝醇與角鯊烯含量的差距在縮短，鯊肝醇占18.23％，而角鯊烯占60.32％。試驗(yàn)結(jié)果說明中性氧化鋁柱層析技術(shù)能有效分離純化鯊魚肝油中的鯊肝醇。

角鯊烯是由6個異戊二烯連接而成的高度不飽和的直鏈三萜類化合物，常溫下為淡黃色或無色油狀液體,具有提高缺氧耐受力功能，抑制微生物生長，抗菌消炎，調(diào)節(jié)膽固醇代謝等生物活性功效，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)中。角鯊烯來源廣泛，存在于微生物、植物種籽、微藻、鯊魚肝臟及人體皮脂中。然而，因植物及其加工副產(chǎn)物中角鯊烯含量過低而無法滿足實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)所需，鯊魚肝油仍是生產(chǎn)高純度角鯊烯的主要原料。鯊魚肝油主要含有角鯊烯、烷基甘油及少量EPA、DHA、維生素A及維生素E等多種人體所需的營養(yǎng)素，是高品質(zhì)魚肝油之一。為了定量分析富集前、后鯊魚肝油中角鯊烯含量的變化，繪制角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線。本研究中角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品氣相分析結(jié)果如圖9a所示，由于在測定角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)未衍生化處理，故角鯊烯的出峰時(shí)間約在15.017min，比圖8中的出峰時(shí)間提前了2.7min左右。角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖9b所示，橫坐標(biāo)為角鯊烯質(zhì)量濃度(μg/mL)，縱坐標(biāo)為峰面積，線性回歸方程為

y=1.921x+6.089，R²=0.9999。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得，富集前角鯊烯純度為54.21％，而富集后角鯊烯純度為49.18％。分析其原因可能是：中性氧化鋁層析柱對角鯊烯的吸附效果較強(qiáng)，而洗脫液未及時(shí)有效地將角鯊烯洗脫。一般地，常用硅膠柱分離、純化角鯊烯，選擇正己烷與乙酸乙酯復(fù)配作為洗脫液。

綜上所述，中性氧化鋁柱層析能有效分離純化鯊肝醇.并對鯊魚肝油不皂化物中的角鯊烯有篩選作用。在今后的研究中可用已脫除角鯊烯的不皂化物為原料進(jìn)行鯊肝醇制品的富集純化。

2.3.3 方法學(xué)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證GC儀器的穩(wěn)定性，在鯊魚肝油不皂化物中添加角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行精密度及回收率的試驗(yàn)。本研究選取10，100，400μg/mL與800μg/mL進(jìn)行試驗(yàn)。在相同條件下連續(xù)平行測試3d，每個質(zhì)量濃度平行測定5次，計(jì)算日間精密度和日內(nèi)精密度。由表5可知，在日問精密度與日內(nèi)精密度檢測中回收率在98.71％～101.98％，RSD在2.76～8.65，結(jié)果表明該儀器有較高的穩(wěn)定性與精密度。

3 結(jié)論

采用粒徑100～200目的中性氧化鋁為填料，研究其柱層析制備鯊肝醇制品的方法。采用TLC對樣品進(jìn)行定性分析，GC對樣品進(jìn)行定量分析并驗(yàn)證儀器穩(wěn)定性與精密度。采用響應(yīng)面法優(yōu)化中性氧化鋁柱層析分離、純化鯊肝醇工藝參數(shù)，得到最佳反應(yīng)參數(shù)為：洗脫液比例(V_二氯甲烷：V_無水甲醇)9:1，上樣量3g，洗脫流速2mL/min，所得鯊肝醇制品純度達(dá)18.23％。對鯊肝醇富集前、后的組成成分分析可知，中性氧化鋁柱層析分離、純化鯊肝醇的同時(shí)，會對不皂化物中角鯊烯的含量造成損失。角鯊烯純度由54.21％減至49.18％。本文尚未有效分離鯊魚肝油不皂化物中的鯊肝醇與角鯊烯，今后將繼續(xù)開展鯊肝醇分離純化技術(shù)及功能活性等研究。

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