槐枝為常用中藥，最早收載于《別錄》，《新修本草》中又名嫩槐枝，為豆科植物槐的嫩枝，具有散瘀止血，清熱燥濕，祛風(fēng)殺蟲之功效，主治崩漏、赤白帶下、痔瘡、陰囊濕癢、心痛、目赤、疥癬等，每年4～5月采收，曬干或鮮用?？杉鍦?、浸酒或燒灰內(nèi)服，亦可煎水熏洗、燒瀝涂。

槐枝含有較多的黃酮類化合物，臨床上常用于治療咽炎、中耳炎、膿皰瘡等，其中蘆丁為主要藥效成分。蘆丁又稱蕓香苷，是一種存在于多種植物中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，因此用蘆丁含量作為測(cè)定槐枝的質(zhì)量控制指標(biāo)具有重要意義。

槐枝在歷版國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、《山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》及《山東省中藥飲片炮制規(guī)范》中均未收載，在部分省級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中有收載。但是檢驗(yàn)項(xiàng)目及內(nèi)容比較單一，有的地方標(biāo)準(zhǔn)中無檢驗(yàn)項(xiàng)目，有的地方標(biāo)準(zhǔn)中檢驗(yàn)項(xiàng)目有性狀、顯微鑒別、薄層鑒別及常規(guī)的藥材檢查項(xiàng)目。上述標(biāo)準(zhǔn)中均無含量測(cè)定方法，《遼寧省中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第二冊(cè)》2019年版中薄層鑒別前處理方法復(fù)雜，展開劑用到易制毒試劑丁酮，因此優(yōu)化槐枝的薄層色譜鑒別方法及建立高效液相色譜法測(cè)定蘆丁含量具有重要意義。
目前文獻(xiàn)中對(duì)槐枝的質(zhì)量評(píng)價(jià)多采用其高麗槐素、蘆丁、槲皮素以及揮發(fā)油的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。但成麗等采用高效液相色譜法測(cè)定槐枝中高麗槐素含量，方法重現(xiàn)性好，但是因?yàn)楦啕惢彼貙?duì)照品制備繁瑣，不利于廣泛普及。陳華國(guó)等采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定槐枝中蘆丁和槲皮素含量，以甲醇–0.01mol/L乙酸銨(體積比為47∶53)混合溶液為流動(dòng)相，流動(dòng)相中需要加入鹽溶液，配制比較復(fù)雜，操作不當(dāng)容易阻塞色譜柱，損壞高效液相色譜儀。熊維政等利用高效液相色譜法測(cè)定國(guó)槐槐枝及槐葉中蘆丁含量，并進(jìn)行了比較，采用的流動(dòng)相配制簡(jiǎn)便，但是樣品提取過程中沒有考察溶劑的影響，不能精準(zhǔn)地測(cè)定槐枝中蘆丁含量。趙超等以蘆丁為對(duì)照品，利用分光光度法測(cè)定槐枝中總黃酮類含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品處理過程繁瑣，操作復(fù)雜。張艷焱等采用水蒸汽蒸餾法分別提取新鮮和干燥槐枝中的揮發(fā)油，用氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法分析和鑒定其化學(xué)成分，方法對(duì)儀器及操作者水平要求較高，不適用于槐枝的日常檢驗(yàn)。

筆者收集了10批槐枝飲片樣品，以蘆丁含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)樣品提取條件、薄層色譜展開劑、色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了槐枝的薄層色譜鑒別法及高效液相色譜法測(cè)定其中蘆丁含量的方法。該方法操作簡(jiǎn)單、分離度好、經(jīng)濟(jì)環(huán)保，準(zhǔn)確度高，為槐枝質(zhì)量控制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定了研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC–20AT型，LCsolution工作站，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司公司。數(shù)控超聲波清洗器：KQ–600GDV型，昆山市超聲儀器有限公司。高速萬能粉碎機(jī)：FW100型，天津市泰斯特儀有限公司。電子天平：MS204TS型，感量為0.01mg，瑞士梅特勒–托利多儀器公司。蘆丁對(duì)照品：批號(hào)為100080–201811，含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為91.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院。硅膠G薄層板，青島海洋化工廠分廠。甲醇：色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?。冰醋酸：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。槐枝飲片樣品：10批，編號(hào)分別為1～10，均為豆科植物槐SophorajaponicaL.的嫩枝，經(jīng)干燥，切片制得，產(chǎn)地均為山東。其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

1.2 薄層色譜鑒別

1.2.1 對(duì)照品溶液制備

取蘆丁對(duì)照品適量，加入甲醇溶解，配制成蘆丁的質(zhì)量濃度為2mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液制備

稱取2g槐枝粉末（過二號(hào)篩，篩孔直徑為2000μm），加入30mL石油醚（30～60℃）超聲處理（500W，頻率40kHz）20min，過濾，棄去濾液，濾渣揮干溶劑后，加入50mL甲醇超聲處理（500W，頻率40kHz）30min，過濾，取濾液蒸干，殘?jiān)尤?mL甲醇溶解，所得溶液即為供試品溶液。

1.3 高效液相色譜法測(cè)定

1.3.1 色譜條件

色譜柱：KromasilC₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm，瑞典諾力昂公司）；流動(dòng)相：甲醇–1%冰醋酸溶液（體積比為32∶68）；檢測(cè)波長(zhǎng)：257nm；流量：1.0mL/min；柱溫：36℃；進(jìn)樣體積：10μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品0.10282g，置于50mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至標(biāo)線，搖勻，過濾，取續(xù)濾液2mL，置于250mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至標(biāo)線，搖勻，配制成蘆丁的質(zhì)量濃度為15.1μg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.3 供試品溶液制備

精密稱取槐枝粉末（過二號(hào)篩）約0.5g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50mL，密塞，稱量并記錄質(zhì)量，超聲處理（500W，頻率40kHz）30min，冷卻，再次稱量質(zhì)量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 薄層色譜鑒別條件選擇

按照《中國(guó)藥典》2020年版槐米的薄層鑒別方法，選擇1號(hào)槐枝樣品粉末（過二號(hào)篩）2g，加入50mL甲醇超聲處理（500W，頻率40kHz）30min，過濾，取濾液蒸干，殘?jiān)尤?mL甲醇溶解，作為供試品溶液。按1.2.1方法制備對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法（2020年版《中國(guó)藥典：四部》　通則　0502）試驗(yàn)方法，分別吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各2μL和5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯–甲醇–水（體積比為8∶1∶1）溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，待乙醇揮干后，置于紫外光燈（365nm）下檢視，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，供試品色譜圖中，沿著展開過程，有明顯的未完全分離的熒光斑條，在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置上，有相應(yīng)的未分離完全的熒光斑點(diǎn)，點(diǎn)樣量2μL及5μL無明顯區(qū)別，結(jié)果表明，供試品色譜圖中，雖然含有蘆丁，但是因?yàn)闃悠冯s質(zhì)較多，提取條件或展開劑選擇不恰當(dāng)，導(dǎo)致斑點(diǎn)未完全分離。

考慮到槐枝樣品中含有色素等極性較大的物質(zhì)較多，先對(duì)樣品進(jìn)行脫色處理。稱取3份槐枝粉末（過二號(hào)篩）樣品，各2g，分別加入石油醚（30～60℃）、石油醚（60～90℃）、乙醚各30mL，分別超聲處理20min；再稱取3份槐枝粉末（過二號(hào)篩）樣品，各2g，分別加入石油醚（30～60℃）、石油醚（60～90℃）、乙醚各30mL，分別回流提取20min，將處理后的6份樣品分別過濾，棄去濾液，濾渣揮干溶劑后，加入50mL甲醇超聲處理（500W，頻率40kHz）30min，過濾，取濾液蒸干，加入2mL甲醇使殘?jiān)芙?，制?份供試品溶液。以乙酸乙酯–甲醇–水（體積比為8∶1∶1）溶液為展開劑，考察不同提取溶劑及提取方法的展開效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以石油醚（30～60℃）、超聲處理20min展開結(jié)果最好，供試品色譜圖在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)位置上，能顯示出相同顏色的斑點(diǎn)，但是斑點(diǎn)有拖尾。在展開劑中加入少量甲酸，斑點(diǎn)分離效果好，無拖尾現(xiàn)象，故樣品提取方法選擇先加入石油醚（30～60℃），超聲處理20min，然后加入50mL甲醇提取，展開劑選擇乙酸乙酯–甲醇–甲酸–水（體積比為8∶1∶1∶1）溶液。

相關(guān)鏈接：乙醚，乙酸乙酯，石油醚，蘆丁

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