熱激轉(zhuǎn)錄因子在植物適應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫的過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，賦予植物多種抗逆性。熱激轉(zhuǎn)錄因子家族成員序列大小不一，但結(jié)構(gòu)域比較保守，主要包含N端高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它可識別并結(jié)合熱激元件從而激活熱激蛋白基因的轉(zhuǎn)錄；依次是寡聚化結(jié)構(gòu)域，由2個疏水七肽重復(fù)區(qū)域組成，并通過一段可變長度的柔性序列連接到DBD。該結(jié)構(gòu)域可促進(jìn)與HSP啟動子中HSE的結(jié)合，調(diào)控HSP的轉(zhuǎn)錄；接著是核定位信號和核輸出信號，NLS是一簇堿性氨基酸區(qū)域，與進(jìn)入細(xì)胞核有關(guān)。NLS和NES協(xié)同調(diào)控Hsfs在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的分布；C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域含有短肽AHA基序，具有轉(zhuǎn)錄激活功能。根據(jù)Hsfs結(jié)構(gòu)特點，將植物Hsfs分為3個主要亞家族。橡膠樹Hsfs家族共30個成員，也分為HsfsA、B和C。Hsfs能夠識別熱激元件HSE并與之結(jié)合，從而激活下游基因如HSP的轉(zhuǎn)錄，響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫。小麥熱激轉(zhuǎn)錄因子TaHsfA6f調(diào)控一系列下游基因的轉(zhuǎn)錄，參與保護(hù)植物免受高溫?fù)p傷。枇杷EjHsf1通過調(diào)節(jié)下游基因EjHSP的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)低溫脅迫。擬南芥NPR1與HsfA1互作從而激活HsfA1參與低溫脅迫反應(yīng)。DREB2A能夠調(diào)控HsfA3的表達(dá)進(jìn)而響應(yīng)鹽脅迫和干旱脅迫。HsfA4a亦能提高擬南芥的耐鹽性和耐氧化性。植物Hsfs家族成員較多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能多樣，響應(yīng)于多種逆境交叉脅迫，是一類理想的遺傳改良候選基因。

巴西橡膠樹是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，原產(chǎn)于亞馬遜河流域。目前，已大規(guī)模種植于南亞或東南亞以及赤道附近南北緯度10°之間的熱帶地區(qū)，該地區(qū)屬于傳統(tǒng)植膠區(qū)，無低溫侵襲，且雨水充足。我國的橡膠樹種植區(qū)位于熱帶北緣，屬于非傳統(tǒng)植膠區(qū)，經(jīng)常遭遇寒潮侵襲，以及干旱危害。選育高產(chǎn)抗逆品種是保障我國天然橡膠高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的有效途徑。但是，由于橡膠樹育種周期特別漫長，而且因缺乏高效的早期評選技術(shù)，高產(chǎn)性狀和耐寒性狀難于聚合，導(dǎo)致生產(chǎn)上的高產(chǎn)耐寒品種極度匱乏，嚴(yán)重影響我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為了解決這一問題，可開發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記輔助橡膠樹的新品種培育，以及通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高高產(chǎn)橡膠樹品種的耐寒性，創(chuàng)制新品種。本文分析了30個橡膠樹Hsf家族成員在低溫脅迫下橡膠樹‘93-114’和‘熱墾501’樹葉中的表達(dá)模式，還鑒定了Hsf家族成員對干旱和高鹽脅迫的響應(yīng)。研究結(jié)果為進(jìn)一步解析Hsf家族成員的抗逆機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所橡膠樹種苗培育基地培育的橡膠樹無性系‘93-114’和‘熱墾501’袋裝苗，處于穩(wěn)定期一蓬葉幼苗。天根生化科技（北京）有限公司的RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒；Ferments公司的RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒；寶生物工程（大連）有限公司的SYBRPremixExTaq(TliRNaseHPlus)Ⅱ；其他生化試劑及耗材均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑；引物合成由Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

恒溫培養(yǎng)箱（PGR15，COVVILN，加拿大）用于室內(nèi)處理橡膠樹幼苗，設(shè)定28℃培養(yǎng)箱處理對照材料，設(shè)定4℃培養(yǎng)箱低溫處理材料，其他條件設(shè)置為：相對濕度為80%，光照強度為125μmol/(m²·s)，16h光照和8h黑暗。

低溫脅迫的處理方法：將橡膠樹無性系‘93-114’和‘熱墾501’袋裝幼苗轉(zhuǎn)移至28℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2d。然后把材料平均分為2組，以保留在28℃恒溫培養(yǎng)箱中的一組作為對照，轉(zhuǎn)移至4℃培養(yǎng)箱中的一組作為處理。在0、4、8、24h分別采集對照和處理的幼苗樹葉。每個時間段采集5株幼苗樹葉制成1個混合樣，共3次生物學(xué)重復(fù)。

干旱脅迫的處理方法：將‘93-114’袋裝苗在28℃預(yù)培養(yǎng)2d，然后平均分為2組，一組在28℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，另一組除掉袋子和泥土，裸根置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0、2、4、8、12、24h分別收集葉片，每個時間段采集5株幼苗葉片制成1個混合樣，3次生物學(xué)重復(fù)。

鹽脅迫處理方法：將‘93-114’袋裝苗在28℃預(yù)培養(yǎng)2d，然后平均分為2組，一組以400mmol/LNaCl溶液澆灌袋裝苗1次，另一組澆灌同樣體積的水，然后繼續(xù)置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別在0、2、4、8、12、24h6個時間段收集葉片，每個時間段采集5株幼苗葉片制成1個混合樣，3次生物學(xué)重復(fù)。所有采集的樣品都用于提取總RNA。

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的合成

橡膠樹葉片總RNA的提取參照天根生化科技（北京）有限公司的植物總RNA提取試劑盒的操作說明進(jìn)行。cDNA第1鏈的合成根據(jù)Ferments公司試劑盒的操作步驟進(jìn)行。

1.2.3 熒光實時定量PCR分析

采用Bio-Rad公司的CFX實時熒光定量PCR系統(tǒng)，實驗操作按儀器使用說明書進(jìn)行。合成的cDNA溶液稀釋10倍后作為熒光定量PCR分析模板。反應(yīng)體系10µL，包含模板1µL，2×SYBRPremix5µL和每條引物0.3µL，無菌水補足10µL。用于qPCR的Hsfs引物和內(nèi)參HbActin7a引物參照Li等的文獻(xiàn)。PCR反應(yīng)程序為：95℃變性30s；95℃10s，60℃20s，72℃20s，共40個循環(huán)。40個循環(huán)后進(jìn)行溶解曲線分析。利用CFXmanager3.0軟件自動進(jìn)行基線和Cq值分析，算法為2–^△△Cq法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用T-test方法對基因表達(dá)水平進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.01為極顯著差異）。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對熱激轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的影響

依據(jù)橡膠樹幼苗耐寒性室內(nèi)評價鑒定體系，對30個橡膠樹Hsfs家族成員在低溫脅迫下‘93-114’和‘熱墾501’葉片中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。在30個橡膠樹Hsf家族中，24個成員在‘93-114’葉片中的本底表達(dá)量顯著高于‘熱墾501’（圖1）。在低溫條件下，HbHsfA3b、HbHsfA4a、HbHsfA4d、HbHsfA5b、HbHsfA8a、HbHsfA9b、HbHsfC1a、HbHsfC1b、HbHsfB1a和HbHsfB2b在橡膠樹‘93-114’和‘熱墾501’葉片中均呈顯著上調(diào)表達(dá)模式，其中HbHsfA4a、HbHsfA4d、HbHsfA9b、HbHsfC1a和HbHsfC1b在‘93-114’葉片中的表達(dá)量顯著高于‘熱墾501’。C亞家族中的2個基因HbHsfC1a和HbHsfC1b在‘93-114’和‘熱墾501’葉片中的表達(dá)模式非常相似，對低溫脅迫比較敏感。在‘93-114’和‘熱墾501’葉片中均呈顯著下調(diào)表達(dá)的基因有HbHsfA3a、HbHsfA4b、HbHsfA5a、HbHsfB4c和HbHsfB4d五個基因，但是這些基因在‘93-114’葉片中的表達(dá)量顯著高于‘熱墾501’。另外，還有7個基因在‘熱墾501’中顯著上調(diào)表達(dá)，而在‘93-114’中呈顯著下調(diào)表達(dá)模式，其中HbHsfA7a和HbHsfB2c在‘93-114’中的轉(zhuǎn)錄水平依然高于‘熱墾501’（圖1）。

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