1 引言

氯霉素是第一個(gè)人工合成的廣譜抗生素，因其效高價(jià)廉，在中國(guó)畜牧業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，對(duì)畜禽疾病的控制和治療起到了重要的作用。隨著氯霉素的廣泛應(yīng)用及研究的深入，發(fā)現(xiàn)其有許多毒、副作用，因此，必須控制氯霉素在動(dòng)物性食品中的殘留，保障消費(fèi)者健康與安全。試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋雞多劑量?jī)?nèi)服氯霉素后，氯霉素在雞蛋中的藥動(dòng)學(xué)特征是：易于吸收，多分布于蛋黃；氯霉素在蛋黃中的殘留水平高，且在蛋黃中的消除較蛋白緩慢。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定氯霉素禁止用于所有食品動(dòng)物。氟苯尼考是一種農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的動(dòng)物專(zhuān)用抗菌藥，主要用于敏感細(xì)菌所致的豬、雞、魚(yú)的細(xì)菌性疾病，尤其對(duì)呼吸系統(tǒng)感染和腸道感染療效明顯，GB31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定家禽產(chǎn)蛋期禁止使用氟苯尼考。目前檢測(cè)雞蛋中氯霉素類(lèi)藥物殘留量主要采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T22338—2008《動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物殘留量測(cè)定》，在檢測(cè)雞蛋過(guò)程中發(fā)現(xiàn)一些可以?xún)?yōu)化和改進(jìn)的步驟。本方法是采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)雞蛋中的氯霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臋z測(cè)方法的研究，雞蛋中的氯霉素、氟苯尼考?xì)埩粑锿ㄟ^(guò)制備、提取、凈化、氮吹、復(fù)溶，過(guò)濾后進(jìn)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析測(cè)定。通過(guò)改進(jìn)和優(yōu)化，本方法更加簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確的測(cè)定雞蛋中的氯霉素、氟苯尼考。

2 材料和方法

2.1 試劑與材料

ABSCIEXAPI4000+UPLC/MS/MS質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)ABSciex公司，配有Turbo-V離子源、蠕動(dòng)泵和Analyst1.5.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；WatersAcquityUPLC超高效液相色譜儀；WatersACQUITYUPLC BEH1.7μmC18（2.1×100mm），KQ-250DV超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Millipore超純水機(jī)（美國(guó)Milipore公司）；LC-Si硅膠小柱（3mL，200mg，美國(guó)WATERS公司）；0.22μm有機(jī)系針筒式微孔濾膜（上海安譜公司）；色譜純乙腈（德國(guó)，默克公司）；色譜純甲醇（德國(guó)，默克公司）；色譜純正丙醇（德國(guó)，默克公司）；色譜純丙酮（賽默飛世爾科技（中國(guó)））；色譜純正己烷（羅恩試劑）；XS205DU電子天平（梅特勒）；氯霉素、氯霉素D5和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

2.2 樣品前處理

雞蛋經(jīng)攪拌混勻，取5g置于50mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液100μL和30mL5%甲酸乙腈溶液，均漿，10000r/min離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入250mL分液漏斗中，加入15mL乙腈飽和的正己烷，振蕩5min，靜置分層，乙腈層轉(zhuǎn)移至100mL棕色雞心瓶中，殘?jiān)?0mL乙腈重復(fù)提取一次。混合乙腈層，向雞心形瓶加入5mL正丙醇，40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干。殘?jiān)?mL丙酮+正己烷（1+9）溶解。殘?jiān)芙庖喝窟^(guò)LC-Si硅膠小柱（預(yù)先以5mL丙酮+正己烷（1+9）活化），再用5mL丙酮+正己烷（6+4）洗脫，收集洗脫液于15mL離心管中，40℃水浴中氮?dú)獯蹈?，?mL（v）5%甲酸乙腈復(fù)容，過(guò)0.22μm濾膜，待測(cè)。空白試驗(yàn)：除不稱(chēng)取樣品，其余操作同上提取凈化步驟。

2.3 儀器條件

液相分離條件：色譜柱：C18色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm）。流動(dòng)相：A相水；B乙腈。流速：0.3mL/min；柱溫：35℃，進(jìn)樣體積2μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

質(zhì)譜檢測(cè)條件：離子源：電噴霧電離源（ESI-）；檢測(cè)方式：多選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；噴撞氣CAD：中速；氣簾氣CUR：35psi；噴霧氣GS1：50psi；輔助加熱氣GS2：50psi；霧化電壓：-4500V；離子傳輸溫度：550℃。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別取氯霉素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000μg/mL）0.1mL、氯霉素D5內(nèi)標(biāo)溶液（100μg/mL）0.1mL至100mL容量瓶，用乙腈定容，配制成1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液和100ng/mL氯霉素D5內(nèi)標(biāo)工作溶液。取1mL標(biāo)準(zhǔn)中間液至10mL容量瓶中，以乙腈稀釋并定容成濃度為100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別移取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.05、0.1、0.5、2.0、5.0mL及氯霉素D5內(nèi)標(biāo)工作溶液1mL于10mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋制成濃度為：0.5、1.0、5.0、20.0、50.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，吸取0.25mL氯霉素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000μg/mL）定容到1mL，得250.0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，氯霉素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍0.5、1.0、5.0、20.0、50.0、100.0、250.0ng/mL。氯霉素內(nèi)標(biāo)濃度為10ng/mL。

3 結(jié)果與分析

3.1 質(zhì)譜條件的確定

氟苯尼考含有酰胺基團(tuán)，在負(fù)離子模式下易形成［M+H］+準(zhǔn)分子離子，目前研究檢測(cè)氟苯尼考（LC-MS/MS）方法均采用負(fù)離子模式，分別取100ng/mL氯霉素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液、氯霉素D5內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)質(zhì)譜，通過(guò)全掃描（SCAN）和選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）進(jìn)行條件優(yōu)化，氯霉素等藥物信息及質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化條件見(jiàn)表2。

3.2 液相條件的確定

流動(dòng)相水相比較了純水、0.1%甲酸水溶液，5mmol乙酸銨溶液，有機(jī)相比較了甲醇和乙腈等組合時(shí)色譜峰的出峰情況。用純水作為流動(dòng)相，水相比較0.1%甲酸水溶液、5mmol乙酸銨溶液，基線噪音略大，水相為0.1%甲酸水溶液，氯霉素、氟苯尼考峰形較好，但是氟苯尼考的響應(yīng)值較純水作為流動(dòng)相下降很多；用5mmol乙酸銨溶液作為水相，氟苯尼考的響應(yīng)值較純水作為流動(dòng)相也下降近50%；有機(jī)相選用甲醇和乙腈時(shí)，使用乙腈時(shí)氟苯尼考的響應(yīng)更好，而且最終樣品以5%甲酸乙腈溶解，選擇水和乙腈作為流動(dòng)相。

3.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

本文比較了乙腈、1%甲酸乙腈，5%甲酸乙腈作為提取溶劑時(shí)加標(biāo)回收率情況，使用5%甲酸乙腈作為提取溶劑，樣品加標(biāo)回收率更好，故樣品前處理使用5%甲酸乙腈作為處理溶劑。40℃水浴中氮?dú)獯蹈珊?，?fù)溶試劑的選擇，GB/T22338—2008標(biāo)準(zhǔn)中以1mL水作為溶劑溶解，通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較表明：水作為復(fù)溶的溶劑做出的回收率較低，特別對(duì)于氟苯尼考使用的是外標(biāo)法定量，即使氯霉素使用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果也是偏低，用水復(fù)溶效果不理想，改用1%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈復(fù)溶，氯霉素和氟苯尼考的響應(yīng)值都得到改善，回收率也大大提高，5%甲酸乙腈溶解的標(biāo)準(zhǔn)品峰形更好，所以選擇5%甲酸乙腈作為復(fù)溶的試劑。

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