甜葉菊（SteviarebaudianaBertoni）屬多年生菊科草本植物，原產(chǎn)于南美洲和巴西的高山草甸，特別是南美巴拉圭東北部。甜葉菊中富含甜菊糖苷，被廣泛用作天然甜味劑。有研究報道從甜菊提取物中鑒定出89種化合物，并將其分為多酚類化合物、萜類化合物、氨基酸衍生物、脂肪酸及其衍生物類、低聚糖、糖脂類、嘌呤和維甲酸等。這些化合物具有多種生物活性，如抗氧化，抑菌，抗腫瘤等。甜菊提取物中的多酚和黃酮類化合物具有很強的體外清除自由基的能力。然而，關(guān)于甜葉菊提取物體內(nèi)抗氧化活性的研究鮮有報道。在生產(chǎn)甜菊糖苷的過程中會產(chǎn)生大量的絮凝廢渣，其中含有大量的多酚類化合物，而這些副產(chǎn)物尚未得到充分利用。研究甜葉菊廢渣提取物的抗氧化、抗衰老作用，對充分開發(fā)利用甜葉菊資源具有重要意義。

本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對兩種甜葉菊廢渣提取物中的主要成分進行定量分析，并測定其對D-半乳糖致衰老小鼠血清、肝臟和腦組織中一些重要的抗氧化指標（如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和丙二醛（MDA），以及腦組織中Nrf2及其靶基因（SOD1，GPx1，HO-1）的mRNA表達水平的影響等，探討甜葉菊廢渣提取物對D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用，為其進一步開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1、試驗材料

兩種甜葉菊廢渣提取物，晨光生物科技集團股份有限公司。

2、實驗動物

SPF級昆明種雄性小鼠（33～37g，SPF級，8周齡），軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK-（軍）2012-0004。

3、主要試劑

D-半乳糖（分析純級），國藥集團化學試劑有限公司；茶多酚（茶多酚＞88%、EGCG＞40%、兒茶素=0.76%），成都華高生物制品有限公司；咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素、槲皮苷（純度均≧98%），成都瑞芬斯生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、丙二醛（MDA）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA法蛋白定量試劑盒、高純總RNA快速提取試劑盒（離心柱型），北京百泰克生物技術(shù)有限公司；FastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒（去基因組），天根生化科技（北京）有限公司；甲醇（色譜級），北京邁瑞達科技有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

4、儀器與設(shè)備

Agilent1290超高效液相色譜，美國安捷倫科技有限公司；DY89Ⅱ勻漿機，寧波新芝生物科技有限公司；SpectraMax13連續(xù)波長多功能酶標儀，美國MolecularDevices公司；3K15臺式離心機，德國Sigma公司；S1000PCR擴增儀、CFX96熒光定量PCR儀，美國伯樂公司；NanoDropTM2000微量紫外-可見光分光光度計，美國賽默飛世爾公司。

5、試驗方法

（1）兩種甜葉菊廢渣提取物中主要成分的定量分析

本實驗室研究人員前期研究證實，甜葉菊廢渣提取物的主要成分為咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素和槲皮苷。采用HPLC法對兩種甜葉菊廢渣提取物中的主要成分進行定量分析。高效液相色譜條件為：AgilentEclipsePlusC18色譜柱（50mm×2.1mm，1.8μm），流動相為0.1%甲酸（A）和甲醇（B），流速0.1mL/min。洗脫程序：0～10min，10%～50%（B）；10～12min，50%～10%（B）；12～15min，10%（B）。檢測波長320nm和360nm，柱溫30℃，進樣量1μL。采用咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素和槲皮苷為標準品，按上述色譜條件分別測定。以標準品的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制HPLC標準曲線，并測定兩種甜葉菊廢渣提取物中各主要成分的含量。

（2）甜葉菊廢渣提取物對D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用

①小鼠飼養(yǎng)條件

小鼠飼養(yǎng)于北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，室內(nèi)通風條件良好，正常晝夜變化（9:00-21:00），相對濕度（40±5）%，室溫（21±2）℃。

②實驗分組及操作

80只實驗小鼠適應(yīng)7d，喂食普通飼料，自由飲水、覓食。適應(yīng)期后，隨機等分為正常組、D-半乳糖組、兩種甜葉菊廢渣提取物低、中、高劑量組（分別灌胃100，200，500mg/kgbw甜葉菊廢渣提取物），每組10只，同時用苦味酸對小鼠進行編號。各組在灌胃的同時，D-半乳糖組和甜葉菊廢渣提取物組，頸背部皮下注射5%的D-半乳糖溶液（500mg/kgbw），正常組注射等體積的生理鹽水。每日給藥1次，持續(xù)時間為11周。

③待測樣本制備

實驗結(jié)束后，小鼠禁食（不禁水）11h。11h后，小鼠摘眼球取血，全血收集于干凈的1.5mL離心管中，37℃水浴15min，4000×g離心15min分離血清，-80℃保存待測。采血后，將小鼠斷頸處死并解剖，取出肝臟和腦組織并將其在預冷的生理鹽水中漂洗，去除血液，用濾紙吸干表面水分。將肝臟和腦組織一部分放入小離心管里，立即放入液氮（-196℃）中速凍，轉(zhuǎn)入超低溫冰箱（-80℃）存放，備用。另一部分剪碎，加入9倍0.9%預冷的生理鹽水，置玻璃勻漿器中冰水浴迅速研磨制成組織勻漿，4℃，12000×g離心15min，取上清液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

④血清及組織抗氧化指標的測定

測定血清、肝和腦組織勻漿中SOD，GPx活力及MDA含量，檢測方法具體操作按試劑盒說明進行。

⑤熒光定量PCR檢測小鼠腦mRNA表達水平

采用高純總RNA快速提取試劑盒提取各組小鼠腦組織中總RNA，使用NanoDropTM2000微量紫外-可見光分光光度計檢測其完整性及其濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并置于-20℃保存。通過SYBRGreen法進行熒光定量，反應(yīng)體系如下（20μL）：無RNA酶水7.4μL，SuperRealPreMixPlus（SYBRGreen）10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA模板1μL。RT-PCR反應(yīng)條件：94℃預變性3min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR分析。計算方法采用比較CT值法。涉及的引物序列見表1。

(3）數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準偏差（Mean±SD）表示，用單因素方差分析（one-wayANOVA）及多重比較（Duncan）進行差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。

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