多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法是目前測定地表水中糞大腸菌群的常用標準方法,通過三種方法對糞大腸菌群標準物質和實際地表水樣進行分析檢測,結果表明:多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法用于糞大腸菌群的檢測結果具有一致性;通過三種方法優(yōu)缺點的對比,多管法成本低適用于常規(guī)檢測,紙片法高效方便更適用于大批量快速檢測,酶底物法操作簡單,不受場地限制可直接現(xiàn)場檢測,更適用于應急現(xiàn)場監(jiān)測。

前言

糞大腸菌群又稱耐熱大腸菌群，是在44.5℃能生長并發(fā)酵乳酸產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。環(huán)境地表水中的糞大腸菌群主要來自糞便的污染，因此通過測定水中糞大腸菌群的含量，可間接得出水體受糞便污染的情況，是當前國內外環(huán)境監(jiān)測部門主要監(jiān)測項目之一，是評價水體污染程度和環(huán)境衛(wèi)生的重要指標，在《地表水環(huán)境質量（GB3838—2002）》中，規(guī)定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ類水糞大腸菌群的含量依次≤200、200～2000、2000～10000、10000～20000及20000～40000個/L，我國地表水體糞大腸菌群含量普遍較高，部分水域含量甚至超過Ⅴ類水質標準。

多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法是目前國內測定地表水中糞大腸菌群常用的標準方法。多管發(fā)酵法早在1985年就列入《生活飲用水標準檢驗方法（GB5750-85）》，并于2018年發(fā)布修訂版，是糞大腸菌群測定的經典方法，它作為《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）》中的推薦方法，美國公共衛(wèi)生協(xié)會（APHA）出版的《水和廢水標準檢驗方法（20版）》中方法9221E也采用的是多管發(fā)酵法；紙片法在西方發(fā)達國家運用較少，主要在一些發(fā)展中國家使用，環(huán)保部在2015年發(fā)布了紙片法的標準方法，它作為《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）》中的推薦方法（C類方法）；酶底物法是一種新型酶技術檢測方法，已在美、日、韓和歐洲許多國家使用,2003年從美國引入我國，環(huán)保部在2018年發(fā)布了酶底物法的標準方法。三種方法均是糞大腸菌群檢測的標準方法，但在檢出限、檢測時間和操作過程等存在差異，本文參照環(huán)保行業(yè)標準，分別從糞大腸菌群標準物質和實際地表水樣進行檢測分析和對比研究，并從監(jiān)測時間、成本、環(huán)境等總結出各方法的優(yōu)缺點和適用范圍，為廣大環(huán)境監(jiān)測分析人員根據(jù)實際條件和水樣類型選擇最佳方法分析測試提供借鑒與參考。

1實驗部分

1.1試劑和材料

乳糖蛋白胨培養(yǎng)基，EC肉湯培養(yǎng)基，糞大腸紙片I、II型，糞大腸菌群有證標準物質，DST(deflned)MMO-MUG酶底物試劑，無菌水，陽性菌株：大腸埃希氏菌ATCC25922，陰性菌株：產氣腸桿菌ATCC13048。

1.2儀器和設備

采樣瓶，隔水式恒溫培養(yǎng)箱：GNP-9160，恒溫培養(yǎng)箱：HH.B11.420-135-Ⅱ，高壓蒸汽滅菌器：YXQ-LS-100G，程控定量封口機：2009D,97孔定量盤，標準陽性比色盤，接種環(huán)，1mL移液管，試管：15mm×150mm。

1.3實驗方法

多管發(fā)酵法HJ347.2—2018；紙片法HJ755—2015；酶底物法HJ1001—2018。

2實驗結果與討論

2.1空白對照

空白對照用無菌水做全程序空白測定。(1)多管發(fā)酵法：初發(fā)酵和復發(fā)酵的管中均無顏色變化，滿足標準空白要求；(2)紙片法：培養(yǎng)后的紙片上無任何微生物生長，滿足標準空白要求；(3)酶底物法：培養(yǎng)后的97孔定量盤中無顏色反應，滿足H標準空白要求。

2.2陽性及陰性對照

按多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法三種方法實驗要求進行培養(yǎng)，陽性菌株呈現(xiàn)陽性反應；陰性菌株呈現(xiàn)陰性反應。

2.3糞大腸菌群標準物質的結果（見表1)

由表1可知，三種方法對糞大腸菌群標準物質的六次測試結果均在可接受范圍（83～312067MPN/L）內；從標準樣品檢測結果的相對標準偏差來看，多管發(fā)酵法為3.37%，紙片法為2.44%，酶底物法為1.87%，均滿足各自對應方法標準中相對標準偏差的要求；從相對誤差來看，多管發(fā)酵法為3.72%，紙片法為2.6%，酶底物法為3.34%，均滿足各自對應方法標準中相對誤差的要求。

2.4實際地表水樣結果（見表2)

18個不同環(huán)境地表水樣同時用多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法在相同條件下進行檢測，為了使數(shù)據(jù)成正態(tài)分布，先對數(shù)據(jù)進行取對數(shù)后進行統(tǒng)計學分析，運用SPSS兩兩進行雙樣本配對t檢驗。

由表2數(shù)據(jù)可以看出，相關系數(shù)r分別為0.983、0.990、0.993，說明三組數(shù)據(jù)相關性較好；各組的t值分別為0.056、0.124、0.247，均小于t0.05(17)=2.110，說明三種方法對同一樣品的分析結果無統(tǒng)計學意義上的顯著性差異，即多管法、紙片法和酶底物法的實驗結果具有一致性。

2.5三種方法的優(yōu)缺點對比（見表3)

由表3可知，從實驗操作來看，多管發(fā)酵法需要配置培養(yǎng)基并滅菌，進行復發(fā)酵，分析時間是48h左右、監(jiān)測時間長、操作過程煩瑣且在滅菌環(huán)境下檢測；紙片法和酶底物法均可即時接種開始實驗，較為簡便，酶底物法接種的工作量明顯比多管和紙片法少很多，效率最高，紙片法相比多管法而言無須進行復發(fā)酵，效率比多管法高。從儀器設備來看，紙片法只需要隔水培養(yǎng)箱，多管法和酶底物法除了隔水培養(yǎng)箱外，均還需要一個設備。從經濟成本來看，單個樣品的成本多管發(fā)酵法最低，其次為紙片法，酶底物法成本最高。

3結語

通過多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法對標準樣品和實際地表水樣的實驗對比研究可知，同一樣品三種方法對糞大腸菌群檢測結果無統(tǒng)計學上顯著性差異，其結果具有一致性。它們作為環(huán)保標準方法，各有優(yōu)缺點，可根據(jù)不同的條件和要求選擇合適的方法。多管發(fā)酵法和紙片快速法已經列為《國家地表水環(huán)境質量監(jiān)測網(wǎng)監(jiān)測任務作業(yè)指導書（試行）》的指定方法。

綜上所述，多管發(fā)酵法應用最為廣泛，適用于水樣稀釋倍數(shù)未知的情況和環(huán)境監(jiān)測部門的常規(guī)檢測；紙片法更適用于大批量樣品的快速檢測；酶底物法雖成本昂貴，但操作簡單，對檢測環(huán)境沒有特殊要求，更適用于環(huán)境事故應急監(jiān)測。

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