2.7.3 偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）

為了進(jìn)一步分析造成不同批次樣品之間差異的化學(xué)成分，在PCA的基礎(chǔ)上進(jìn)行PLS-DA處理。模型區(qū)分參數(shù)R2Y=0.966，模型預(yù)測參數(shù)Q2=0.91，表明建立的模型有效穩(wěn)定。同樣可將16批樣品分為3類，進(jìn)一步驗(yàn)證了HCA和PCA的結(jié)果；以PLS-DA模型中重要性投影（VIP）值>1.0篩選不同批次樣品間的差異性成分，VIP值的大小表明了對樣品分類的貢獻(xiàn)度的程度。據(jù)圖5可知，共找到8個成分，分別為：13號峰（黃芪異黃烷苷）、11號峰（人參皂苷Rg1）、7號峰（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、21號峰（7,2'-二羥基-3',4'-二甲氧基異黃烷）、6號峰（松脂醇二葡萄苷）、16號峰（毛蕊異黃酮）、20號峰（芒柄花黃素）、4號峰（綠原酸），表明這8種成分對黃蛭益腎膠囊質(zhì)量差異影響較大。8種成分分別來自于黃芪、三七、益母草、墨旱蓮、杜仲，其中5個成分歸屬于君藥黃芪藥材，進(jìn)一步說明黃芪藥材對黃蛭益腎膠囊的質(zhì)量影響較大。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別考察了超聲提取方法的不同提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇和甲醇）、提取時間（30、45、60 min）和提取料液比（1∶5、1∶10、1∶15）等影響因素，從提取的色譜信息全面性、色譜峰的響應(yīng)、操作便捷性等方面考慮，確定供試品溶液最佳制備方法為加10倍量甲醇超聲提取30 min。比較了4種不同流動相系統(tǒng)（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水），乙腈-0.05%磷酸水作為流動相所得色譜峰形、響應(yīng)及分離度均較好；采用DAD檢測器對檢測波長進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在210 nm處的圖譜信息較多，峰響應(yīng)較高；由于樣品中極性大的成分較多，優(yōu)先考慮親水性型色譜柱，分別選擇Waters Atlantis T3(250 mm×4.6 mm,5μm）、Inter Sustain AQ-C18(250 mm×4.6 mm,5μm）、Waters Symmetry Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5μm）、Waters XBridge®Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5μm），同一色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果表明Waters XBridge®Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5μm）色譜柱的分離效果較好，峰數(shù)量較多且分離度較好，故采用該款色譜柱。

本研究建立了黃蛭益腎膠囊的指紋圖譜，16批樣品中確定24個共有峰，通過HPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定了化合物，并通過陽性藥材和陰性制劑樣品比對歸屬到7味藥材。相似度評價結(jié)果表明16批黃蛭益腎膠囊相似度在0.925～0.995，總體上質(zhì)量較為均一。但通過HCA、PCA和PLS-DA化學(xué)模式分析，16批黃蛭益腎膠囊共有峰峰面積存在差異，從而造成樣品之間的質(zhì)量差異。通過聚類圖可知，16批樣品被分為3類，結(jié)合樣品批號信息，3類間的差異可能與生產(chǎn)時間、藥品儲存、原藥材質(zhì)量有關(guān)。以PLS-DA模型中的VIP值選出8種差異性成分，可作為控制黃蛭益腎膠囊質(zhì)量的關(guān)鍵，這幾種成分分別來自黃芪、三七、杜仲、益母草、墨旱蓮，提示生產(chǎn)企業(yè)以后在藥品生產(chǎn)中應(yīng)該著重關(guān)注以上成分的變化以及這幾味原藥材的質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)操作簡單，可行性高，實(shí)用性強(qiáng)，基于指紋圖譜的基礎(chǔ)上初步分析了藥品物質(zhì)基礎(chǔ)，為黃蛭益腎膠囊所含成分的進(jìn)一步分析奠定基礎(chǔ)，為更加科學(xué)、高效地控制藥品質(zhì)量提供參考依據(jù)。黃蛭益腎膠囊所含藥味眾多，本實(shí)驗(yàn)指紋圖譜歸屬到的藥材僅7味，還有枸杞、薏苡仁、山藥等藥材成分未在此指紋圖譜結(jié)果中體現(xiàn)，主要是由于這類藥材所包含成分多為水溶性等大極性成分，色譜分離難度較大，針對此類化合物的分析后續(xù)擬采用HILIC模式進(jìn)行分析。黃蛭益腎膠囊中的黃芪、牛膝、三七等藥材同樣包含大量皂苷類成分，此類成分在紫外中沒有吸收，日后可結(jié)合蒸發(fā)光散射（ELSD）或電噴霧（CAD）檢測器開展其成分分析，以期完善其成分分析。

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