幾丁質(zhì)是在自然界中含量僅次于纖維素的天然生物大分子，主要存在于海洋無脊椎動(dòng)物、昆蟲的殼及真菌的細(xì)胞壁。幾丁質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，溶解性差，導(dǎo)致應(yīng)用受限。幾丁質(zhì)脫去一定程度的乙?；玫綒ぞ厶恰ぞ厶呛写罅康挠坞x氨基和堿性陽離子，溶解性提高，生物相容性好，應(yīng)用廣泛，導(dǎo)致全球市場上殼聚糖供不應(yīng)求。

目前，殼聚糖的制備方法有化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法利用濃堿熱解處理幾丁質(zhì)，使其脫去其中的乙?；枪I(yè)上廣泛使用的方法。但是，化學(xué)法產(chǎn)物品質(zhì)不受控制，并會(huì)引起嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。生物法，反應(yīng)條件溫和，催化過程易控，而且解決了化學(xué)法造成的環(huán)境污染問題，極具應(yīng)用潛力。但生物法尚未工業(yè)大規(guī)模利用，原因是其方法應(yīng)用的瓶頸問題是幾丁質(zhì)對聚合度較高的脫乙酰酶(Chitindeacetylase，CDA)活性不高。

目前報(bào)道的幾丁質(zhì)脫乙酰酶多產(chǎn)于真菌。真菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶對真菌的營養(yǎng)、真菌細(xì)胞壁的合成和完整、芽孢的形成等起到關(guān)鍵作用，但是發(fā)酵水平較低，難以應(yīng)用。細(xì)菌產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶報(bào)道較少，且報(bào)道的菌株中大部分分泌的幾丁質(zhì)脫乙酰酶只催化寡聚幾丁質(zhì)脫乙酰。海洋微生物豐富多樣，本研究從海洋樣品中篩選幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生菌，對菌株進(jìn)行鑒定，對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為該菌株的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1、材料與儀器

樣品來源：海泥樣品采集于連云港高公島碼頭；富集培養(yǎng)基：幾丁質(zhì)2.5g／L、K₂HP0₄0.7g／L、KH₂P0₄0.3g／L、MgS0₄0.5g／L，陳海水配置，pH7.0；平板篩選培養(yǎng)基：幾丁質(zhì)2g／L、K₂EHPO₄0.7g／L、KH₂P0₄0.3g／L、MgS0₄0.5g/L、對硝基乙酰苯胺0.2g／L、瓊脂20g／L，陳海水配置，pH7.0；種子培養(yǎng)基：蛋白胨5g／L、酵母粉lg／L，陳海水配置，pH7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨lOg／L、ZnSO₄0.5g／L、木薯淀粉11g／L，陳海水配置，pH7.9。
SW-CJ-1D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；分光光度計(jì)：杭州明基科學(xué)儀器有限公司；SPX-250B-2生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽：上海-恒科技有限公司；Nikon90i全電動(dòng)顯微鏡：上海普赫光電科技有限公司。

2、實(shí)驗(yàn)方法

（1）產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶海洋細(xì)菌的篩選

初篩：稱取lg泥樣，加入富集培養(yǎng)基，在30℃、180r／min培養(yǎng)72h。取富集培養(yǎng)液100uL均勻涂布于篩選培養(yǎng)基，30℃、培養(yǎng)3～5d，挑取周圍出現(xiàn)明顯黃色圈的菌落，在LB培養(yǎng)基中進(jìn)一步劃線純化并保存。

復(fù)篩：將初篩得到的菌株分別接到種子液中，30℃、180r／min搖床培養(yǎng)24h，再以1％的接種量將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180r／min搖床培養(yǎng)72h，取上清為粗酶液并進(jìn)行酶活力測定和催化α-幾丁質(zhì)脫乙酰的測定。選取酶活力較高，并能催化幾丁質(zhì)脫乙酰的菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

酶活性和催化α-幾丁質(zhì)脫乙酰的測定按照報(bào)道的方法進(jìn)行。酶活單位(U)定義：在上述反應(yīng)條件下每小時(shí)產(chǎn)生對硝基苯胺所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

（2）菌株MCDA02的鑒定

根據(jù)伯杰氏細(xì)菌手冊對MCDA02進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定。用Axygen試劑盒提取MCDA02的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，16SrDNA通用引物采用27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，反應(yīng)體系為：PCRmix(12.5μL)，上下游引物(各lgL)，DNA模板(2μL)，水(9.5μL)。反應(yīng)程序：94℃變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，32個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物送至南京思普金公司測序。序列測定后，提交GenBank數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行BLAST比較分析，利用MEGA7軟件進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

（3）單因素優(yōu)化菌株MCDA02發(fā)酵產(chǎn)CDA培養(yǎng)基

在原發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，保證接種量l％、30℃、裝液量20％、180r／min發(fā)酵72h的發(fā)酵條件不變，改變培養(yǎng)基中的碳源：葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、豌豆粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉，氮源：蛋白胨、尿素、牛肉膏、豆粕、玉米漿(干粉)、米糠、花生粕、麩皮、NaN0₃、NH₄C1、(NH₄)₂S0₄，無機(jī)鹽：MgS0₄、CuS0₄、CaCl₂、NaH₂P0₄、KH₂P0₄、MnS0₄、ZnS0₄、BaCl₂、FeCl₃，分別取樣測定酶活力，確定最佳碳源、氮源及無機(jī)鹽。

（4）單因素優(yōu)化菌株MCDA02發(fā)酵產(chǎn)CDA發(fā)酵條件

確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基后，將種子液以l％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、裝液量20％、180r／min發(fā)酵96h，每隔12h取樣測酶活力，確定最佳發(fā)酵時(shí)間；將種子液以1％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量20％、180r／min，在不同溫度下培養(yǎng)72h，取樣測定酶活力，確定最佳發(fā)酵溫度；將種子液以1％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、裝液量20％、180r／min，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基不同初始pH，培養(yǎng)72h后測定酶活力，確定最佳培養(yǎng)基起始pH；將種子液以1％接種量接種至不同裝液量發(fā)酵培養(yǎng)基，30V、180r／min，培養(yǎng)72h后測定酶活力，確定最佳裝液量；將種子液以不同接種量接種至裝液量為20％的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、180r／min，培養(yǎng)72h后測定酶活力，確定最佳接種量。

（5）響應(yīng)面優(yōu)化菌株MCDA02發(fā)酵產(chǎn)CDA發(fā)酵條件

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對產(chǎn)酶影響最顯著的三個(gè)變量為因變量，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化發(fā)酵條件。

3、數(shù)據(jù)處理與分析

每組試驗(yàn)設(shè)置3組平行，重復(fù)試驗(yàn)3次，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差(n=3)表示，采用Origin2018作圖，響應(yīng)面采用DesignExpert10進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

二、結(jié)果與分析

1、幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生菌的篩選

通過變色圈法總共篩選得到了3株有變色圈的菌株，將這些菌株進(jìn)行劃線分離純化，保存于斜面培養(yǎng)基中，置于4℃冰箱保存。將初篩得到的菌株接入種子培養(yǎng)液中，30℃搖床培養(yǎng)24h后，以1％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72h，分別測定其酶活力。選取酶活力最高的作為實(shí)驗(yàn)菌株，即為MCDA02。

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