1 Introduction

副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，常見于蝦、魚、貝類等海產(chǎn)品中，極易引起腹瀉。在中國和印度的沿海地區(qū)和非沿海大城市，該細菌已成為主要的食源性病原體。副溶血性弧菌的致病性，包括溶血活性、腸毒性和細胞毒性，主要歸因于毒力基因tdh和trh的存在，它們編碼耐熱性直接溶血素（TDH）和TDH相關溶血素（TRH）。

蝦以其獨特的口感和營養(yǎng)價值，成為世界上最美味、最受歡迎的食物之一。對于消費者來說，其新鮮度被認為是最重要的因素，因此，冷凍是最廣泛使用的保持其新鮮度的工藝。在冷凍過程中，副溶血性弧菌會經(jīng)歷洗滌、冷凍、解凍等應激過程。為了減輕這些脅迫，該病原菌啟動多種防御策略，如產(chǎn)生冷休克蛋白，然而攜帶tdh和/或trh基因的致病株可以顯著增加其對凍結(jié)條件的抵抗力。因此，在冷凍蝦制品中帶有tdh和/或trh基因的副溶血性弧菌是值得關注的食品安全問題。

此外，許多報道指出，在冷凍過程中，會出現(xiàn)副溶血性弧菌轉(zhuǎn)變?yōu)榭纱婊畹豢膳囵B(yǎng)（VBNC）狀態(tài)。VBNC細胞在固體培養(yǎng)基上通常會失去培養(yǎng)能力，但在適當?shù)臈l件下仍然具有功能活性，并具有潛在的致病性，在合適的條件下可以復蘇。近年來，食品行業(yè)一直在關注致病菌的VBNC細胞可能會逃避檢測，并仍然保持毒性。然而，很少有研究關注食品加工過程中對VBNC細胞的誘導及其致病性的變化。

近期，西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院在本文中測定了中國對蝦在冷凍加工過程中副溶血性弧菌的毒力變化，包括數(shù)量、VBNC狀態(tài)、毒素和毒力基因等，以了解該病原菌在加工脅迫下的致病性和分子適應情況，為今后的凍蝦加工提供科學依據(jù)和支持。

2 Results and Discussion

在冷凍過程中，副溶血性弧菌ATCC17802和ATCC33847分別降低了0.90（lg (CFU/mL)）和1.55（lg (CFU/mL)）（圖1）。其中，瀝干階段降低最顯著，分別為0.55（lg (CFU/mL)）和1.45（lg (CFU/mL)）。在噴淋階段，他們的數(shù)量也出現(xiàn)下降，但只有ATCC17802呈顯著下降。在速凍階段兩株細菌數(shù)量變化都沒有明顯差異。而在渡冰衣階段，兩株菌的數(shù)量均略有上升趨勢，分別為0.30（lg (CFU/mL)）和0.26（lg (CFU/mL)），這表明副溶血性弧菌在長期的冷凍過程中也能生長。

為了檢測對蝦冷凍加工過程中VBNC狀態(tài)的副溶血性弧菌，從5個關鍵控制點采集細菌，使用LIVE/DEAD® BacLightTM細菌活力試劑盒染色，用激光共聚焦顯微鏡觀察，并將染色結(jié)果用ImageJ軟件對綠色活菌計數(shù)。加工過程中，兩株菌在速凍前迅速減少，但在之后開始緩慢增加，這與平板計數(shù)結(jié)果不同。在瀝干階段細菌數(shù)量明顯下降，說明清洗能夠減少附著在對蝦上的副溶血性弧菌。然而在共聚焦激光顯微鏡觀察下，在噴淋階段細菌的減少是因為副溶血性弧菌已經(jīng)進入了VBNC狀態(tài)，這說明在制作凍被時，細菌開始逐漸進入VBNC狀態(tài)

在對蝦冷凍加工過程中，副溶血性弧菌ATCC17802和ATCC33847菌株接種到中國對蝦后，在我妻氏血瓊脂平板上產(chǎn)生清晰的透明溶血環(huán)。與此同時，陽性對照組（接種副溶血性弧菌菌液）和陰性對照組（對蝦中未接種副溶血性弧菌），均很難在我妻氏血瓊脂上觀察到類似溶血環(huán)。這些結(jié)果表明，副溶血性弧菌接種中國對蝦后，這些菌株的毒力會變的更強。

隨后對凍蝦加工過程中副溶血性弧菌總?cè)苎钚赃M行測定。副溶血性弧菌ATCC17802的溶血活性較低，但在冷凍過程中仍從OD570值的0.23緩慢上升至0.35。但是副溶血性弧菌ATCC33847，其溶血活性迅速增加2倍以上（OD570值從0.49到1.08），并從噴淋解凍階段后繼續(xù)增加。這些結(jié)果表明，這些副溶血性弧菌菌株即使在冷凍的環(huán)境中仍然具有毒性。

兩株菌的tlh基因的相對表達量在加工過程中都表現(xiàn)出相似的增長規(guī)律，說明基因表達的結(jié)果是可靠的。在冷凍過程中，副溶血性弧菌ATCC17802的trh基因相對表達量逐漸下調(diào)，在瀝干和噴淋解凍階段比前一階段減少了將近一半。然而在噴淋階段后，相對表達量開始上調(diào)，這表明TRH仍能在冷凍環(huán)境下合成，但是會在解凍過程通過水淋導致流失。副溶血性弧菌ATCC33847的tdh則剛好相反，相對表達量逐漸上調(diào)，并在渡冰衣階段增長到接種階段兩倍。這些結(jié)果表明，即使在冷凍溫度下，TRH和TDH仍然可以合成，這與總?cè)苎钚栽囼灥慕Y(jié)果基本一致。

3 Conclusion

在整個加工過程中，兩株副溶血性弧菌的數(shù)量均未大幅度減少，僅分別降低了1.55（lg (CFU/mL)）和0.90（lg (CFU/mL)）。其中，在清洗和噴灑階段，細菌數(shù)量有顯著減少，但這是由不同的因素造成的。通過SYTO9和PI染色，共聚焦激光掃描顯微鏡顯示，水洗是洗滌階段細菌減少的主要原因，而菌株進入VBNC狀態(tài)是噴淋解凍階段平板計數(shù)細菌數(shù)量減少的原因。副溶血性弧菌產(chǎn)生的溶血毒素，在接種到蝦中后毒性增強，且在整個過程中都能檢測到，尤其是在速凍階段，其含量遠遠高于其他階段。tdh和trh基因表達變化也表現(xiàn)出與溶血毒性試驗相似的趨勢。其中tdh基因在凍結(jié)過程中不斷增加，在渡冰衣階段幾乎達到了2倍的表達水平，而trh基因表達水平較低，不到接種前表達水平的一半。

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