建立了高效液相色譜法快速準(zhǔn)確定量微量植物體中重要植物色素（葉綠素a、葉綠素b和葉黃素）的分析方法。微量植物葉片以95%乙醇勻漿超聲提取色素4 h，過濾膜后直接分析。色譜分離選用COSMOSIL氰基柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），以甲醇-水洗脫進(jìn)行洗脫，流速為1.0 mL/min，用二極管陣列檢測器檢測，可在15 min內(nèi)完全植物中三種重要色素的快速分離分析。結(jié)果表明，三種色素在0.05～50 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)均為0.9999）；平均加標(biāo)回收率為90%～110%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜5%；日內(nèi)及日間精密度均＜5%，滿足定量要求。與目前檢測植物色素的方法相比，該方法前處理簡單快速，且采用簡單的甲醇-水體系快速分離植物色素，結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好，可為植物體的生理研究提供基礎(chǔ)。
植物色素是植物體內(nèi)能夠吸收太陽光，并在光合作用時將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的關(guān)鍵物質(zhì)，同時植物的色澤和氣味也受其色素的影響。在綠色植物中，葉綠素是其中最豐富的色素，經(jīng)研究，通常情況下植物的光合速率隨葉綠素含量的升高而增強(qiáng)，同時產(chǎn)量的高低基本依賴于光合速率的快慢。因而，葉綠素含量被普遍當(dāng)作是一個能夠準(zhǔn)確評價植物的光合作用與產(chǎn)量產(chǎn)出的可靠指。葉綠素，分為葉綠素a和葉綠素b，其不溶于水，可溶于有機(jī)溶劑，屬于脂溶性色素。顏色上，葉綠素a呈現(xiàn)藍(lán)綠色，而葉綠素b呈現(xiàn)黃綠色；功能上，研究表明，葉綠素可有效地降低膽固醇、促進(jìn)傷口愈合、解毒、抗癌等。除葉綠素外，葉黃素也廣泛存在于各種植物以及蔬菜水果中，據(jù)相關(guān)研究，葉黃素不僅可以過濾藍(lán)光、保護(hù)視網(wǎng)膜還能夠抗氧化 。另外，一些惡劣的環(huán)境因素如低溫、空氣污染、營養(yǎng)缺乏、干旱等都會影響植物色素的含量與組成，進(jìn)而影響植物的光合速率、香味和顏色。因此葉綠素a含量、葉綠素b含量以及葉黃素含量的準(zhǔn)確測定對研究植物的光合生理與植物特性都具有重要意義。

目前，測定植物色素的常用方法紫外分光光度法、熒光分析法、活體葉綠素儀法、光聲光譜法和高效液相色譜法等。高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)有著高壓、高速、以及高靈敏度的優(yōu)點。該方法經(jīng)液相色譜分離，比現(xiàn)有的紫外分光光度法具有更低的干擾及檢出限；與熒光分析法相比，二極管陣列檢測器更為普及。利用液相色譜定量檢測植物色素含量準(zhǔn)確率高。這3種色素結(jié)構(gòu)相似、性質(zhì)相近，有必要發(fā)展一種能夠很好地分離3種色素且能準(zhǔn)確定量的色譜方法。選擇能獲得對稱峰形的色譜柱、合適的流動相以及合適的流動相比例對于植物體中葉綠素a、葉綠素b以及葉黃素的色譜分離分析十分重要。

本文使用鍵合氰基的氰基色譜柱，以簡單的甲醇和超純水為流動相，建立一種快速定量分析植物體中葉綠素a、葉綠素b以及葉黃素含量的反相高效液相色譜法，極大地提高了植物體中該3種重要色素含量準(zhǔn)確測定的可靠性和速度，為研究植物體的生理特性提供了基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Shimadzu LCMS-2020型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；COSMOSIL型氰基柱（日本半井公司）；FLUKO F6/10-8G型超細(xì)勻漿機(jī)（上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司）；Heraeus型高速低溫離心機(jī)（韓國賀利氏公司）；百萬分之一、十萬分之一OHAUS型電子分析天平（美國奧豪斯公司）；Millipore Simplicity型超純水系統(tǒng)（美國Merck公司）。

無水乙醇、0.45 μm過濾頭、新鮮綠色植物葉片、甲醇（德國CNW公司）、葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品（99.9%）、葉綠素b標(biāo)準(zhǔn)品（99.9%）、葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（99.9%）（美國CIL公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：利用百萬分之一天平準(zhǔn)確稱取0.5 mg葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品、葉綠素b標(biāo)準(zhǔn)品、葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，分別用95%乙醇溶解，于25 mL容量瓶中定容，儲存于-20 ℃冰箱，備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：各取5 mL上述葉綠素a和葉綠素b的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液混合，儲存于-20 ℃冰箱，備用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用上述的混合葉綠素a和葉綠素b的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液以及葉黃素分別逐級稀釋，配制成濃度為0.05、0.5、2.0、10、50 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 植物樣品的前處理

精密稱取0.1 g的綠葉碎片以及綠葉根部各3份，分別加入1 mL 95%乙醇溶液，勻漿，勻漿后放置于冰箱中低溫提取4 h，提取完畢后于4 ℃下高速離心20 min。低溫離心后取上層綠色清液，過0.45 μm微孔濾膜后，置于2 mL液相小瓶中備用。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：氰基柱（4.6 mm × 250 mm，粒徑5 μm），流動相：V（甲醇（A））：V（純水（B））=76:24；流速為1 mL/min，二極管陣列檢測器（PDA）波長為663 nm（葉綠素a）、645 nm（葉綠素b）、445 nm（葉黃素）；柱溫箱溫度40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇

目前，反相高效液相色譜檢測植物色素的流動相復(fù)雜且分離效果差，難以達(dá)到準(zhǔn)確定量的目的。本研究旨在采用常規(guī)流動相水，甲醇，乙腈或其中的兩種到3種混合溶劑對植物中的色素進(jìn)行分析。由于植物色素葉綠素a、葉綠素b以及葉黃素極性較?。ㄏ聢D為3種色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)），所以采用有機(jī)溶劑作為洗脫劑。此外，葉綠素a和葉綠素b結(jié)構(gòu)相似，乙腈洗脫能力較甲醇強(qiáng)，若用乙腈作為洗脫液，兩種色素難以分離，導(dǎo)致影響色素的準(zhǔn)確定量，因此選用甲醇作為洗脫劑。用甲醇和純水作流動相，實驗中不斷改變流動相的比例：V（甲醇）：V（水）為95:5、90:10、80:20、70:30。當(dāng)流動相的V（甲醇）：V（水）=70:30時，葉綠素a、葉綠素b和葉黃素的峰形較好，分離度符合要求，在20 min之內(nèi)出峰。為了進(jìn)一步縮短出峰時間，優(yōu)化峰形，進(jìn)一步優(yōu)化洗脫流動相比例[17]，使得3種植物色素的出峰時間控制在15 min以內(nèi)，最終選用V（甲醇）：V（水）=76:34為流動相進(jìn)行綠色植物中葉綠素a、葉綠素b和葉黃素的分離。

被分析物的洗脫速率影響因素之一為流動相的流速[17]，流速的不同影響著物質(zhì)在色譜中的出峰時間，在不干擾分離效果的條件下，同時節(jié)約時間成本，應(yīng)盡量提高流動相的流速。綜合各種因素，流速以1.0 mL/min為適中。

檢測波長的選定是紫外及熒光類的檢測器的關(guān)鍵。本研究采用的紫外檢測器是全程掃描、二極管陣列的三維檢測器，經(jīng)過多次的嘗試，確定葉綠素a的激發(fā)波長為663 nm；葉綠素b的激發(fā)波長為645 nm；葉黃素的激發(fā)波長為445 nm。

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