2.結(jié)果與討論

2.1儀器測定條件的選擇和優(yōu)化

2.1.1檢測器的選擇

色氨酸由于其特殊結(jié)構(gòu)，既具有紫外吸收，又具有熒光響應(yīng)。為使色氨酸的檢測能夠獲得較高的靈敏度, 需要確定色氨酸的最大吸收波長和最佳激發(fā)波長與發(fā)射波長。研究中首先通過二極管陣列檢測器（DAD）將色氨酸標準溶液在波長190~450 nm范圍內(nèi)進行掃描,結(jié)果表明,在檢測波長280 nm處，色氨酸有明顯的特征吸收峰，且基質(zhì)干擾較少，故將吸收波長280 nm作為紫外檢測器檢測色氨酸的檢測波長。同時將最大吸收波長280 nm作為激發(fā)波長通過熒光檢測器對色氨酸標準溶液進行發(fā)射光譜掃描，觀察到色氨酸在波長346 nm處具有較高的靈敏度。因此,實驗最終確定熒光檢測器激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為346 nm。

經(jīng)大量樣本檢測表明，在相同流動相條件下，部分樣品的紫外色譜圖中在目標物的保留時間處有難以分離的干擾峰，并影響到定量結(jié)果的準確性，故采用熒光檢測器進行檢測和定量。樣品紫外檢測器譜圖和熒光檢測器譜圖見圖1。

2.1.2流動相的選擇

流動相比較了0.1%的乙酸溶液-甲醇和10 mmol/L 醋酸銨溶液（pH=4.0）-甲醇體系的洗脫情況，結(jié)果表明在0.1%的乙酸溶液條件下個別樣品中有明顯的干擾峰，且難以與目標物有效分離，導致定量結(jié)果不夠準確。而10 mmol/L 醋酸銨溶液（pH=4.0）條件下目標峰和內(nèi)標峰均可以與干擾峰（圖2，峰3）達到基線分離。譜圖見圖2。

a-甲醇-0.1%乙酸溶液b-甲醇-醋酸銨溶液

2.2試樣前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 堿的選擇

在樣品堿水解的過程中，考察不同的堿對水解結(jié)果的影響。方法研究中，選擇蛋白質(zhì)含量最高的乳粉基質(zhì)作為實驗對象，選取了相同濃度（4 mol/L）的LiOH、NaOH和KOH 3種堿溶液在相同試驗條件下進行試驗，考察堿水解后色氨酸含量的變化，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，在相同的條件下，使用LiOH溶液處理的樣品中色氨酸含量最高，使用外標法定量回收率83%，而NaOH溶液和KOH溶液對試樣中的色氨酸有不同程度的破壞，回收率只有76%和70%，故方法選定LiOH溶液作為水解過程中的堿溶液。

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