如圖2所示，當牡蠣發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為4％時，氨基態(tài)氮的含量最高，但是蛋白質含量未達到最低。接種量在繼續(xù)增加的同時，氨基態(tài)氮和蛋白質二者的含量走向都呈現(xiàn)降低趨勢。這可能是因為在接種量過低時，納豆芽孢桿菌繁殖較慢，產酶過少；而當菌種接種量過大時，菌種繁殖過快，密度過大，導致氧氣接觸不足，導致代謝產物較少。而且牡蠣肉作為納豆芽孢桿菌繁殖代謝的主要營養(yǎng)基質，其中豐富的蛋白質被納豆芽孢桿菌自身分泌的蛋白酶分解成寡肽和氨基酸，使得發(fā)酵液中含有豐富的氨基態(tài)氮。而當發(fā)酵液中小分子肽和氨基酸含量與蛋白質含量相差較多時，納豆芽孢桿菌會優(yōu)先消耗小分子物質，從而導致當接種量過多時蛋白質與氨基態(tài)氮的含量均隨之逐漸降低。表明在接種量2％～6％之間時，氨基態(tài)氮處于含量最高期。

如圖3所示，當接種量固定為4％時，發(fā)酵時間在12h～48h范圍內，氨基態(tài)氮的含量在不斷增加，在發(fā)酵時間為48～60h時稍有下降，可能是由于納豆芽孢桿菌消耗蛋白質的同時開始利用小分子的氨基酸導致，也有可能是因為蛋白酶活力在發(fā)酵48h時達到最大，發(fā)酵時間是影響納豆芽孢桿菌產酶的重要因素，在產酶總量達到最大值之后繼續(xù)發(fā)酵可能會導致蛋白酶酶活下降。在12h～60h期間，蛋白質的含量在不斷下降。在36h～48h期間氨基態(tài)氮含量與蛋白質含量的變化趨緩，此時的納豆芽孢桿菌在水解蛋白質和消耗氨基酸的過程中處于平衡期。納豆芽孢桿菌產酶最高值后應立即停止發(fā)酵，否則酶活力會出現(xiàn)回落現(xiàn)象。因此，在固定條件接種量為4％和發(fā)酵時間48h下進行后續(xù)試驗。

2、正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件

在固定料液比l:4(g／mL)，發(fā)酵溫度37℃和葡萄糖添加量2％的基礎上，對單因素試驗的數(shù)據(jù)結果進行分析并選取合適的發(fā)酵條件范圍，以發(fā)酵pH、接種量、發(fā)酵時間為主要因素，并以測定的氨基態(tài)氮含量作為參考，進行三因素三水平L₉(3³)正交優(yōu)化試驗，具體試驗方案和結果見表1。

由表1分析可知，以氨基態(tài)氮含量為指標，各因素的影響依次為A＞B＞C，即接種量對氨基態(tài)氮含量的影響最大，其次是發(fā)酵時間，發(fā)酵pH對氨基態(tài)氮含量的影響最小。由正交試驗結果分析確定最佳優(yōu)化工藝條件：A₃B₃C₂，即發(fā)酵pH為7，接種量為6％，發(fā)酵時間為48h。

由表2方差分析可知，此次試驗的三個因素中，接種量對氨基態(tài)氮含量具有顯著性影響(P＜0．05)，發(fā)酵時間和發(fā)酵pH對試驗結果無顯著性影響(P＞0.05)。

3、驗證試驗

為驗證正交試驗所得結果的可靠性，在上述最佳發(fā)酵工藝條件下進行三次平行試驗并測定發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量。經測定，所得發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量為0．785mg／mL，與正交試驗結果接近，證實試驗結果可靠。

三、結論

本試驗以低價購買市場淘汰的牡蠣廢料作為發(fā)酵主要原料，用納豆芽孢桿菌對其進行發(fā)酵，可以提高牡蠣的利用價值。固定料液比1:4，發(fā)酵溫度37℃和葡萄糖添加量2％，通過單因素試驗選取適宜發(fā)酵條件范圍：發(fā)酵pH為6～8，接種量為2％～6％，發(fā)酵時間為24h～48h。在此基礎上，通過正交設計優(yōu)化試驗確定納豆芽孢桿菌發(fā)酵牡蠣的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵pH7，接種量6％，發(fā)酵時間48h，此時發(fā)酵液中氨基態(tài)氮的含量達到0．791mg／mL。

本試驗的發(fā)酵結果表明，納豆芽孢桿菌可以用于牡蠣的發(fā)酵，為水產動物的應用提供了理論基礎，為蛋白高值化提供了依據(jù)，同時為水產品的開發(fā)提供新的方向，充分利用市場淘汰的牡蠣邊角料。而且，發(fā)酵水解液氨基態(tài)氮含量豐富，水解液經過濃縮提取也可以制備氨基酸口服液、氨基酸含片、氨基酸護膚品、氨基酸添加劑等，本研究為氨基酸產品的制備提供了依據(jù)。

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