茶酒，按生產(chǎn)工藝主要分為配制型茶酒和發(fā)酵型茶酒。其中，配制型茶酒是將茶葉在酒中浸泡，再經(jīng)勾兌、調(diào)配等工藝制成的酒精飲品；而發(fā)酵型茶酒則是以茶葉為主料，以糖、果蔬汁等為配料，經(jīng)酵母或酒曲發(fā)酵而成的飲用酒。目前，無(wú)論是配制型茶酒還是發(fā)酵型茶酒，酒精度通常在20％vol以下，且酒中含有很多茶葉活性物質(zhì)，因此一般將茶酒歸為低度保健型酒。

據(jù)報(bào)道，茶酒中通常含有一定量?jī)翰杷?、沒(méi)食子酸(GA)等活性成分。兒茶素和GA作為重要的食品添加劑，其抗氧化活性已得到了廣泛研究。但目前關(guān)于茶酒的抗氧化活性研究報(bào)道很少，僅何婷婷報(bào)道了一款發(fā)酵型普洱茶酒的抗氧化活性，認(rèn)為該茶酒具有良好的還原能力和清除超氧自由基的能力。

單樅茶酒是我們課題組以單樅茶為原料研制的一款發(fā)酵型茶酒。本研究先對(duì)單樅茶酒的兒茶素及沒(méi)食子酸進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)測(cè)定，然后從方面對(duì)單樅茶酒的抗氧化活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)：(1)還原能力的測(cè)定；(2)清除自由基能力的測(cè)定；(3)抗氧化能力指數(shù)(ORAC)的測(cè)定。這三方面是抗氧化活性的主要測(cè)定方法，尤其ORAC測(cè)定是目前抗氧化研究領(lǐng)域研究熱門(mén)、應(yīng)用廣泛的一項(xiàng)重要評(píng)價(jià)方法。本研究可為單樅茶酒的保健功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。

一、材料與方法

1、實(shí)驗(yàn)材料

單樅茶酒，本課題組制備，具體制備工藝如下：以潮州鳳凰單樅茶(一級(jí)品)為原料，先按茶水比1：40(g/mL)加85℃水浸提茶葉10min以獲得茶汁，然后加人蔗糖至糖度為15^oBx。再添加30g，L硫酸銨作為氮源，并以檸檬酸調(diào)pH至4.0。將茶酒酵母T-5(釀酒酵母ATCC204508經(jīng)茶汁馴化而得，本單位保藏)接入麥芽汁培養(yǎng)成濃度為10⁶cfu/mL的種子液，然后添加到茶汁中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵條件：接種量為體積百分比3.1％，發(fā)酵溫度為21℃，發(fā)酵時(shí)間8d。茶酒制備完畢后密封避光儲(chǔ)藏。

2、主要藥品試劑

乙腈和甲醇(色譜純)，美國(guó)J.T.Baker公司；4種主要兒茶素標(biāo)品表兒茶素(EC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、表沒(méi)食子酸兒茶素(EGC)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)及沒(méi)食子酸(GA)標(biāo)品，純度均≥98％(HPLC)，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、2，2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)、水溶性維生素E(Trolox)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；熒光素鈉(FL)，美國(guó)Fluka公司；甲酸、L(+)-抗壞血酸、K₂S₂0₈、K₃[Fe(CN)₆]、Na₂HP0₄、NaH₂P0₄、三氯乙酸(TCA)、FeCl₃、食用酒精、十二烷基硫酸鈉(SDS)、鄰苯三酚、水楊酸、H₂0₂、Al(N0₃)₃、FeS0₄、NaN0₂、Na₂S₂0₃、NaOH、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、硫酸銨、檸檬酸、乙醇、鹽酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純；pH8.OTris-鹽酸緩沖液的配制：精確稱取121.1gTris于1000mL容量瓶中，加入800mLdd水，充分?jǐn)嚢枞芙?。再加?2mL鹽酸，dd水定容。

3、主要儀器設(shè)備

KQ-300VDE三頻超聲波震蕩器，上海五相儀器儀表有限公司；Agilent1260LC高效液相色譜儀，美國(guó)AGILENT公司；MK3型酶標(biāo)儀，芬蘭ThemoLabsystems公司；U-3010型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本HTACHI公司；TDL-16C型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亨科學(xué)儀器廠；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市精達(dá)儀器制造廠，96孔熒光板，丹麥NUNC公司。

4、實(shí)驗(yàn)方法

（1）單樅茶酒中兒茶素和GA的HPLC測(cè)定

先將兒茶素和GA標(biāo)品分別配成5mg/mL的單標(biāo)溶液，然后再混合并配成l、2、4、8、10、20mg/L的混標(biāo)溶液，然后進(jìn)行HPLC測(cè)定，建立各標(biāo)品的標(biāo)曲方程。然后再將茶酒樣品HPLC測(cè)定，并通過(guò)標(biāo)曲方程計(jì)算出茶酒中的兒茶素和GA含量。

HPLC色譜條件：AgilentZORBAxSB-C₁₈(4.6×250mm，5μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈(A)，0.2％甲酸水溶液(B)；流速：1.2min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm；梯度洗脫，程序如表1。

（2）單樅茶酒還原能力的測(cè)定

還原能力測(cè)定依據(jù)的是物質(zhì)供電子能力大小的原理。參考何婷婷的方法并作改進(jìn)。在5支10mL試管中分別滴入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL單樅茶酒，分別用dd水補(bǔ)至1.0mL，加入0.2mol/LpH6.6的磷酸緩沖液2.5mL，再加入1％的K₃[Fe(CN)₆]2.5mL，振蕩混勻，然后于50℃水浴中反應(yīng)15min并迅速冷卻。加入10％的TCA1.0mL，振蕩混勻，4000r/min離心5min。取上清液2.5mL，加入2.5mLdd水和0.5mL0.1％的FeCl₃，混勻后靜置15min，于700nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ao，以dd水代替Fecl₃作空白，操作如上，測(cè)出吸光度氏，用兩吸光度差值表示還原能力大小，即：還原能力=A₁-Ao。

將食用酒精與蒸餾水勾兌，使酒精度達(dá)到單樅茶酒的酒精度8.35％vol。然后將該勾兌酒及0.1mg/mL的抗壞血酸作為對(duì)照，測(cè)定方法如上。

（3）單樅茶酒清除自由基能力的測(cè)定

單樅茶酒對(duì)DPPH·、ABTS·、·OH以及O₂·四種自由基的清除能力強(qiáng)弱，也可作為反映單樅茶酒抗氧化活性強(qiáng)弱的一項(xiàng)依據(jù)。分別對(duì)單樅茶酒清除上述自由基的能力進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)，各測(cè)定過(guò)程中均以0.1mg/mL的抗壞血酸作對(duì)照。

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