2.3.2 色譜條件

以Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm,5μm）為色譜柱；乙腈（A)-0.1%甲酸（B）為流動相梯度洗脫（0～7 min,5%A;7～35 min,5%～28%A;35～53 min,28%～90%A;53～65min,90%A）；體積流量1.0 m L/min；柱溫30℃；檢測波長為275 nm；進樣量為10μL。

2.3.3 精密度試驗

稱取樣品粉末0.25 g(S5），按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以MMQ(S）峰為參照峰，計算色譜圖中特征峰相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果顯示RSD分別為0.05%～0.49%和0.39%～2.15%。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取同批次砂藍刺頭粉末（S5)1份，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項下色譜條件分別于0、1、2、4、6、12、24 h進樣，以MMQ峰為參照峰，記錄和計算各共有峰相對保留時間、相對峰面積。結(jié)果顯示RSD分別為0.06%～0.54%和0.33%～1.89%。

2.3.5 重復性試驗

取同一批次砂藍刺頭粉末（S5)6份，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項下色譜條件進樣，以MMQ為參照峰，記錄和計算各共有峰保留時間、相對峰面積，計算其RSD分別為0.07%～1.11%和0.32%～3.19%。

2.3.6指紋圖譜的建立與分析

按“2.3.1”項和“2.3.2”項對樣品進行制備和測定，記錄色譜圖。運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)研究版（2004版）”，導入S1～S9號樣品HPLC數(shù)據(jù)，以S1為參照圖譜，選擇平均數(shù)法進行自動峰匹配，生成EGT對照指紋圖譜（圖2-A）。以EGT對照指紋圖譜為參照圖譜，同時導入7批（S10～S16）藍刺頭屬其他種樣品HPLC圖譜數(shù)據(jù)，選擇平均數(shù)法進行自動峰匹配，得到藍刺頭屬其他種圖譜（圖2-B）并計算相似度。

計算得到S1～S9號樣品相似度分別為0.970、0.950、0.922、0.989、0.959、0.978、0.980、0.916、0.697，偽品相似度分別為0.849、0.452、0.806、0.327、0.499、0.580、0.832。除批號為20120815樣品外，其余EGT樣品相似度均在0.9以上，種內(nèi)相似度較高，而藍刺頭屬其他種植物樣品相似度均低于0.9。

將S1～S9號樣品與藍刺頭屬其他種樣品的指紋圖譜進行比較，并結(jié)合各色譜峰的峰形、峰高以及分離情況等信息，標定了8個特征峰，并經(jīng)對照品指認4個峰，分別為2號峰是水楊酸、4號峰是綠原酸、5號峰是MMQ、6號峰是異綠原酸，其中MMQ是本研究發(fā)現(xiàn)的含量較高的專屬性成分，其色譜峰的對稱性好、峰較高，與相鄰色譜峰達到基線分離，故選定MMQ為參照峰（S）。并計算得到各特征峰相對保留時間的RSD均小于3%，表明特征峰的出峰時間較為穩(wěn)定，但其相對峰面積的RSD相差較大，表明不同批次中各成分含量存在一定的差異。將16批樣品指紋數(shù)據(jù)進行初步數(shù)據(jù)篩選，篩選出峰面積比>2%的指紋數(shù)據(jù)，結(jié)果導入SIMCA 13.0軟件，進行最小二乘法判別分析（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA）與聚類分析（hierarchical cluster analysis,HCA），結(jié)果見圖3和圖4。從OPLS-DA和HCA結(jié)果顯示，EGT與藍刺頭屬其他種樣品分成2大類，說明所建立的EGT特征指紋圖譜有一定的鑒別作用，可用于EGT的質(zhì)量評價。

VIP結(jié)果顯示13號峰（MMQ）為最主要的貢獻成分，該成分為EGT的專屬性成分，可作為EGT含量測定的指標成分。

2.4 MMQ的定量測定

2.4.1 色譜條件

采用Diamonsil Plus C18(250mm×4.6 mm,5μm）色譜柱；乙腈-0.1%甲酸水溶液（14∶86）為流動相，體積流量為1.0 m L/min，柱溫30℃，檢測波長為230 nm，進樣量為10μL。理論板數(shù)按MMQ峰計不低于2500。對照品溶液和供試品溶液的HPLC見圖5。

2.4.2 供試品溶液的制備

取EGT樣品（過3號篩）0.25 g，精密稱定，置100 m L具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 m L，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W、頻率40 k Hz）處理30 min，放冷，用70%甲醇補充減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4.3對照品溶液的制備

精密稱取MMQ對照品10.12 mg，置于10 m L量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含1.012 mg/m L MMQ的溶液，作為對照品貯備溶液。

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