聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHAs)是一類由羥基脂肪酸單體通過酯化聚合得到的高分子化合物，因具有傳統(tǒng)石油基塑料類似的力學特征、100%生物降解性和生物相容性而被認為是最有潛力的綠色環(huán)保材料之一。受限于其高昂的生產(chǎn)成本，PHAs作為綠色環(huán)保材料的應(yīng)用推廣困難。文中分別從細胞形態(tài)調(diào)控、代謝途徑構(gòu)建、廉價碳源利用和開放式發(fā)酵技術(shù)開發(fā)等方面詳細介紹了目前有效降低PHAs生產(chǎn)成本的方法。盡管大部分研究成果還局限于實驗室階段，但是研究方法和方向為實現(xiàn)低成本PHAs的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論指導。

聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHAs)是一類由羥基脂肪酸單體通過酯化聚合得到的高分子化合物，是微生物在特定環(huán)境下的能量儲備物質(zhì)。隨著白色污染加重和石油資源枯竭，具有傳統(tǒng)石油基塑料相似的力學特征、100%生物降解性和生物相容性的PHAs被認為是最有前景的綠色環(huán)保材料之一。目前只有少數(shù)工廠，例如德國Biomer Inc.、美國P&G、巴西PHB Industrial和中國Tianan Biologic等實現(xiàn)了PHAs的中試級別生產(chǎn)，但產(chǎn)量遠遠無法滿足市場需求。主要原因是PHAs高昂的生產(chǎn)成本(2.2–5.0歐元/kg)大大限制了其作為綠色環(huán)保材料的應(yīng)用。本文首先介紹了PHAs的類型和合成代謝途徑，隨后從細胞形態(tài)調(diào)控、代謝途徑構(gòu)建、廉價碳源利用和開放式發(fā)酵技術(shù)開發(fā)等方面詳細介紹了不同研究團隊在降低PHAs生產(chǎn)成本方面的研究成果，以期為實現(xiàn)低成本PHAs的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導。

1 PHAs簡介

1.1 PHAs分類

根據(jù)單體碳原子數(shù)PHAs可以分為短鏈PHAs(Short-chain-length，SCL)和中長鏈PHAs (Mediumlong-chain-length，MCL)，根據(jù)單體不同排列方式又可以分為均聚物(Homo polymer)、無規(guī)共聚物(Random copolymer)和嵌段共聚物(Block copolymer)。超過150種羥基脂肪酸可以作為PHAs合成的單體，其多元化組合賦予了PHAs性能的多樣性，例如SCL PHAs材料堅硬易碎，MCL PHAs材料韌性良好，按照不同比例混合后的共聚物表現(xiàn)出不同的硬度和韌性，這為開發(fā)不同特性的產(chǎn)品提供了無限可能。

第一代商業(yè)PHAs，聚-3羥基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate，PHB)是3-羥基丁酸(3HB)的均聚物，也是發(fā)現(xiàn)最早、研究最深入的PHAs材料。因為其良好的抗氧化性、防水性和較高的硬度，PHB材料主要被開發(fā)用作包裝材料。但是它較脆的材質(zhì)和接近降解溫度(220℃)的熔解溫度(175℃)不利于熱加工處理。第二代商業(yè)PHAs是由3HB和3-羥基戊酸(3HV)無規(guī)則共聚而成的聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸酯(Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，P(3HB-co-3HV))。

相比于PHB，P(3HB-co-3HV)在熱加工性能、韌性和延展性方面均得到了提高。第三代商業(yè)PHAs是由3HB和中鏈3-羥基己酸(3HHx)無規(guī)則共聚合成的聚-3-羥基丁酸-3-羥基己酸(Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)，P(3HB-co-3HHx))。3HHx的混入給予了材料優(yōu)異的彈性體性能和生物相容性能，因而被開發(fā)用作生物醫(yī)用材料。隨著PHAs研究的進一步發(fā)展，研究人員預測P(3HB-co-4HB)將會成為第四代商業(yè)PHAs，4HB的混入成功克服了PHB質(zhì)地脆弱的缺點。目前PHAs已經(jīng)用于塑料工業(yè)的包裝材料、農(nóng)業(yè)的農(nóng)膜材料以及醫(yī)藥領(lǐng)域的組織工程和藥物緩釋材料等的加工生產(chǎn)中。

1.2 PHAs合成代謝途徑

超過90個屬的500種細菌具有PHAs合成能力，其中PHAs合成代謝途徑主要有3條(圖1，紅色部分)。途徑Ⅰ：從糖酵解途徑(EMP)生成的兩分子乙酰Co A (Acetyl-Co A)依次經(jīng)β-酮基硫解酶(Pha A)和乙酰乙酰Co A還原酶(Pha B)，最后在PHA合酶(Pha C)催化下合成PHB。途徑Ⅱ：同樣以乙酰Co A為起點的脂肪酸從頭合成途徑(de novo synthesis)的中間產(chǎn)物參與PHAs的合成。該途徑的關(guān)鍵酶3-羥基酯酰ACP-Co A轉(zhuǎn)移酶(Pha G)將R-3-羥基酯酰ACP (R-3-hydroxyacylACP)轉(zhuǎn)化為R-3-羥基酯酰Co A (R-3-hydroxyacylCo A)，從而被Pha C催化合成PHAs。途徑Ⅲ：脂肪酸被活化成酯酰Co A后進入β-氧化(β-oxidation)途徑，中間產(chǎn)物S-3-羥基酯酰Co A(S-3-hydroxyacyl-Co A)在差向異構(gòu)酶作用下轉(zhuǎn)換成可以被Pha C催化利用的R-3-羥基酯酰Co A。盡管部分微生物利用脂肪酸合成PHB，但是其主要利用β-氧化途徑生成的乙酰Co A通過途徑Ⅰ合成。

除這3條主要途徑外，微生物體內(nèi)還存在其他PHAs合成途徑，以及通過基因工程構(gòu)建的新的PHAs合成途徑(圖1，藍色部分)。例如從草酰乙酸(Oxaloacetate)出發(fā)，通過基因工程手段為P(3HB-co-3HV)的合成提供3-羥基戊酰Co A (3-hydroxyvaleryl-Co A，3HV)；從琥珀酰Co A (Succinyl-Co A)出發(fā)為P(3HB-co-4HB)合成提供4-羥基丁酰Co A (4-hydroxybutyryl-Co A，4HB)等。

2 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)低成本PHAs

PHAs的生產(chǎn)成本集中在發(fā)酵物料的消耗和滅菌過程的能源消耗上，其中前者占成本的50%，后者占30%。基于此，各個研究團隊希望通過降低發(fā)酵物料成本和滅菌過程能源消耗成本來降低PHAs的生產(chǎn)成本。例如提高菌株產(chǎn)率、利用廉價物料以及開發(fā)開放式發(fā)酵技術(shù)等。

2.1 細胞形態(tài)調(diào)控及代謝途徑構(gòu)建

作為胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，當鹽單胞菌Halomonas campaniensis LS21內(nèi)PHAs充滿細胞體積時也僅達到生物量的60%，這表明PHAs積累量嚴重受限于細胞體積。研究人員發(fā)現(xiàn)通過抑制細胞分裂蛋白Fts Z，由桿狀轉(zhuǎn)變?yōu)榻z狀形態(tài)的重組大腸桿菌E.coli Trans1T1的PHB占比增加了125%。隨后，Wu等發(fā)現(xiàn)基因min CD和細胞骨架蛋白Mer B也具有抑制細胞分裂和調(diào)控細胞形態(tài)的作用，重組大腸桿菌E.coli JM109內(nèi)的PHB積累量達到生物量的80%。基因min CD和fts Z在PHAs生產(chǎn)菌株中同樣具有影響細胞分裂和形態(tài)的作用。過表達min CD的重組鹽單胞菌Halomonas TD08在靜置培養(yǎng)下長成數(shù)百微米的絲狀菌體，PHB含量從68.69%提升至82.04%，即使在振蕩培養(yǎng)下菌絲長度依然是出發(fā)菌株的1.4倍。

為了解決Fts Z和Mer B非正常表達后細胞數(shù)量減少的問題，Jiang等構(gòu)建了溫度敏感表達質(zhì)粒，菌體在30℃時正常生長到預定生物量后升高至37℃，F(xiàn)ts Z和Mer B表達受限，菌體細胞膜剛性遭到破壞、細胞分裂受到抑制，從細桿狀轉(zhuǎn)向粗絲狀的菌體可以實現(xiàn)更多PHAs的積累。這一舉措既實現(xiàn)了發(fā)酵前期生物量積累、發(fā)酵后期菌體存儲空間增大的目的，又消除了基因工程手段對發(fā)酵前期細胞生長的負面影響。

除了形態(tài)調(diào)控，基因工程還適用于構(gòu)建中間物的合成代謝途徑。大部分菌株需利用多種碳源合成共聚物PHAs，例如在培養(yǎng)基中同時提供葡萄糖和丙酸才能獲得共聚物P(3HB-co-3HV)。為了解決這個問題，Tan等強化蘇氨酸合成途徑的同時敲除2-甲基檸檬酸合酶，胞內(nèi)丙酰Co A濃度上升，重組鹽單胞菌TD01實現(xiàn)了單一碳源下P(3HB-co-3HV)的生物合成。同樣的，在單一碳源下，Li等通過敲除琥珀酸半醛脫氫酶基因和過表達orf Z，胞內(nèi)碳通量流向4HB-Co A的合成，為共聚物P(3HB-co-4HB)的合成提供前體。構(gòu)建中間物的合成代謝途徑，一方面避免了使用其他脂肪酸導致的原料成本增加和可能帶來的毒性作用，另一方面為利用微生物直接合成多種類PHAs提供了指導方向。

聲明：本文所用圖片、文字來源《生物工程學報》2021年2月，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系

相關(guān)鏈接：脂肪酸酯，3羥基丁酸酯，草酰乙酸，琥珀酸