5、顯色反應時間影響

取50ml容量瓶一只，加入CAT樣液(酶活性小于2U／mL)1.00mE、H202基質液2.00mL，25℃水浴反應30min后立即加入1.5mL硫酸終止反應，加碘化鉀5mL，60℃水浴加熱40min，冷卻，加淀粉3mL，定容，以蒸餾水作參比液，在波長600nm處測吸光度A，同時完成酶空白試驗吸光度A₀測定，根據(jù)△A(△A=A₀一A)確定過氧化氫酶活性E。其它條件不變，只改變反應時間，測定5～70min內A值(圖3)。30min內吸光度與時間有線性關系。由此可見，H₂O₂氧化KI具有零級反應的特點，反應物起始濃度直接決定了反應速度，40min后反應完全。所以顯色反應時間確定為40min。

6、酶促反應時間影響

取過氧化氫酶工作液10.00mL作測試液，其它條件不變，改變酶促反應時間，測定△Ao以時間t為橫坐標，△A為縱坐標作酶促反應曲線。由圖4可知：在反應初始階段的0～30min內，In△A與時間成正比，符合酶促催化一級反應特征。30min后，△A趨于恒定。因此，確定酶促反應時間為30min。

7、工作曲線

取過氧化氫酶標準溶液0.00—20.00mL作測試液，在最佳條件下完成△A測定，繪制工作曲線(圖5)。過氧化氫酶活力E(U／mL)在0.002～0.04U／mL范圍內與△A呈良好的線性關系：△A=0.06843+16.9866E(U／mL)，r=0.9970。按實驗方法平行測定空白10次，標準偏差s為0.01，檢測限為0.0018U／mL，最低檢出量達到0.15U。

8、干擾試驗

取10.00mL過氧化氫酶標準溶液作測試液，按照試驗方法考察生物組織共存還原性物質干擾情況。結果發(fā)現(xiàn)，2倍于基底液濃度的葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖不影響酶活度測定，測量誤差小于5％。

9、樣品分析

H₂O₂是動物肝臟細胞代謝中間產(chǎn)物，因而肝臟中具有較多的CAT，實驗選取魚肝臟CAT提取液做分析。將新購活魚殺死，剝離肝臟，用濾紙吸干，稱重，按1:10(w／V)加入1～4℃冷0.25mol／L蔗糖液，勻漿，1500r／min下離心5min，取上清液，用0.25mol／L蔗糖稀釋50倍，制得酶粗液，1～4℃環(huán)境中保存。取酶粗液1.00mL完成活性測定，平行六次，計算平均值和相對標準偏差，計算回收率。

回收率控制在96％～105％范圍內，說明粗酶液共存物質不影響酶活性測定；根據(jù)測定結果可推算出魚肝CAT含量分別為550U／g(鯉魚)和537U／g(草魚)。

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