2生物傳感器方法

生物傳感器分析法(BiosensorAnalysis）是以固定化生物活性物質(zhì)（如酶、蛋白質(zhì)、微生物、DNA及生物膜等）為敏感元件，并與適當?shù)奈锢砘蚧瘜W換能器結合制成的一種分析檢測裝置進行分析檢測的方法。1962年，Clark以離子選擇性電極為基礎發(fā)展了具有酶分子識別功能的酶電極。1967年，Updike和Hicks首次將葡萄糖氧化酶（GO）固定在Clark氧電極表面，成功制備了葡萄糖傳感器，從而揭開了有機物無試劑分析的序幕。繼之又出現(xiàn)了微生物傳感器、免疫傳感器、細胞傳感器和組織切片傳感器。20世紀70年代末至80年代，又出現(xiàn)了熱敏電阻型和生物化學發(fā)光式生物傳感器。這些生物傳感器的出現(xiàn)改變了傳統(tǒng)破壞試樣的生化檢驗方法，而且可直接分析、反復使用，便于操作。日前已經(jīng)發(fā)展到活體內(nèi)測定、多指標測定以及聯(lián)機在線測定。檢測對象也已涉及近百種常見的生物化學物質(zhì)，使許多過去極難進行的檢測變得容易，因而在醫(yī)學基礎研究、臨床診斷、環(huán)境醫(yī)學以及發(fā)酵、食品、化工和環(huán)保等方面得到廣泛的應用。

2.1酶傳感器

酶傳感器是發(fā)展最早，也是目前最成熟的一類生物傳感器。它是在固定化酶的催化作用下，生物分子發(fā)生化學變化后，通過換能器記錄變化從而間接測定出待測物濃度。目前國際上已研制成功的酶傳感器有20余種，其中最成熟的是葡萄糖傳感器。使用時將酶電極浸入到樣品溶液中，溶液中的葡萄糖即擴散到酶膜上，在固定于酶膜上的葡萄糖氧化酶作用下生成葡萄糖酸，同時消耗氧氣，通過氧電極測定溶液中氧濃度的變化，推測出樣品中葡萄糖的濃度。MerolaGiovanni等開發(fā)了以過氧化氫的安培電極作為傳感器、過氧化物酶作為標記物的酶傳感器。結果證明了該酶傳感器方法的完全有效性，LOD約為10-10mol/L。羅瑞平[48]合成了金屬改性介孔碳材料，并基于青霉素酶（PenX）設計了2種生物傳感器：PenX-COOH-Co@C/PMB/GCE和PenX-COOH-CoS2@C/PMB/GCE生物傳感器、基于新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1(NDM-1）設計了1種生物傳感器：NDM-1/PMB/GCE傳感器；其中PenX-COOH-Co@C/PMB/GCE和PenX-COOH-CoS2@C/PMB/GCE生物傳感器對青霉素鈉（PenG）的檢測限分別為0.64和0.61ng/mL,NDM-1/PMB/GCE傳感器對氨芐青霉素鈉（AMP）的檢測限為0.35ng/mL，所制備的三種酶傳感器靈敏度高、檢測限低。

2.2電化學生物傳感器

電化學生物傳感器是將電化學傳感器與生物分子特異性識別相結合的一種生物傳感裝置。它是一種將生物體成分（酶、抗原、抗體、激素等）或生物體本身（細胞細胞器、組織等）作為敏感元件，電極（固體電極、離子選擇性電極、氣敏電極等）作為轉換元件，以電勢或電流為特征檢測信號的傳感器。傅迎春等以制備的氯霉素DNA適配體修飾的磁珠以及一段與適配體互補的DNA鏈修飾的金電極制成了電化學生物傳感器，該傳感器檢測氯零素的線性范覆蓋3個數(shù)量級，檢測限低至1ng/mL，與常規(guī)方法相當或更優(yōu)。此外，傳感器具有滿意的特異性、穩(wěn)定性，用于牛奶樣品檢測效果滿意。Mohammad-Razdari[52]等在鉛筆石墨電極（PGE）上制造了基于電化學適體的生物傳感器。在最佳實驗條件下，顯示出從10-15到10-5mol/L的寬線性范圍，對SDM的檢測極限（LOD）為3.7×10-16mol/L。此外，它具有很高的重現(xiàn)性，良好的選擇性和可接受的穩(wěn)定性。SuiChengji[53]等使用石墨狀氮化碳（g-C3N4）納米片作為光敏材料，結合捕獲-釋放策略，制備了一種簡單而選擇性的光電化學生物傳感器。所開發(fā)的方法顯示出從1pmol/L到100nmol/L的寬線性范圍和0.22pmol/L(3sigma）的低檢測限。制成的光電化學生物傳感器還具有良好的檢測特異性，可用于檢測水樣中的氯霉素殘留，回收率在94.5%至107.3%之間。

2.3細胞傳感器

細胞傳感器的分子識別元件采用動植物活細胞，并結合傳感器和理化換能器，產(chǎn)生間斷或連續(xù)的光電信號。某些動植物活細胞內(nèi)還有對目標分析物具有誘導效應的基因，因此可用來制作活體細胞傳感器，當目標分析物進入活體細胞中時，這些基因發(fā)生誘導效應，其可以被目標分析物激活或抑制，此過程被傳感器捕捉并轉化為光電信號，根據(jù)該細胞中基因對不同抗生素的誘導效應可測量多種目標分析物，其原理是采用DNA重組技術重構細胞并用于抗生素殘留檢測，細胞傳感器可分為組成型和誘導型兩種。ChengGuyue等構建了轉基因細菌，帶有質(zhì)粒pRecAlux3的大腸桿菌pK12，以開發(fā)基于生物發(fā)光細菌的檢測動物源性食品中氟喹諾酮類（FQN）的方法。該方法可用于牛奶等11種可食用組織中FQN的檢測。FQN的檢出限在12.5至100μg/kg之間，均低于最大殘留限量。

2.4免疫傳感器

免疫傳感器是將高靈敏的傳感器技術與特異性免疫反應相結合的一種新方法，用于檢測和監(jiān)控抗原抗體之間的反應。免疫傳感器是把抗原或抗體固定在固相支持物表面形成感應器，檢測樣品中的抗體或抗原，然后將感應的信號通過精密換能器輸出，是一種既有選擇性又能定量檢測的固相免疫測試法。RebeRaz等開發(fā)了基于成像表面等離振子共振（iSPR）平臺的微陣列免疫傳感器，用于定量和同時免疫檢測牛奶中的不同抗生素殘留。使用單個傳感器芯片同時檢測了四大類共7種抗生素。通過競爭形式對7種免疫測定進行多重分析，我們能夠在緩沖液和10倍稀釋牛奶中測得十億分之一（ppb）水平的所有目標化合物。

2.5微生物傳感器

微生物傳感器的研究始于1977年Rechnitz用糞便鏈球菌制成測精氨酸的傳感器，而現(xiàn)在已有各種各樣的微生物傳感器用于臨床診斷、食品檢測、發(fā)酵監(jiān)控和產(chǎn)物分析、環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測等。微生物的多樣性、特異性是發(fā)展檢測各種物質(zhì)和多種功能的眾多傳感器的理論基礎，而且相對于其他生物傳感器，微生物傳感器制作較容易，活性較穩(wěn)定，使用壽命長[62]。KumarSanjay[63]建立了一種基于綠膿桿菌的用于檢測頭孢菌素類抗生素的電位型微生物傳感器；初步結果表明，銅綠假單胞菌細胞經(jīng)溶菌酶處理后，在0.1～11mmol/L的濃度范圍內(nèi)對頭孢菌素的檢測效率高于正常細胞；最佳參數(shù)值：細胞含量2.5mg/cm2，明膠8.5mg/cm2，戊二醛0.25%。以磷酸鹽緩沖液pH、離子強度和溫度為檢測條件，優(yōu)化了生物傳感器的檢測性能；對不同內(nèi)酰胺類抗生素的特異性檢測，發(fā)現(xiàn)該微生物傳感器僅對頭孢菌素有較好的響應，且該微生物傳感器存儲及檢測具有高穩(wěn)定性，在檢測頭孢菌素類藥物方面具有良好的應用前景。

3生物芯片技術

1991年，F(xiàn)odor等首先提出DNA芯片（DNAchip）和微陣列（microarray）的概念。生物芯片（Biochip）技術是20世紀90年代初伴隨著人類基因組計劃的實施而產(chǎn)生的一門新技術，已成為高效、大規(guī)模獲取相關信息的重要手段。它主要通過微加工和微電子技術在固相基質(zhì)表面構建微型生物化學分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他生物分子等進行準確、快速、高通量檢測。目前，生物芯片技術已廣泛應用于基因序列分析、疾病診斷、藥物研究、微生物檢測、農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)、食品、環(huán)境保護和檢測等領域。Gaudin等使用專用于六個不同抗生素殘留物篩查的MicroArrayII試劑盒（AMII）評估了一個多陣列系統(tǒng)，稱為Evidence Investigator™（Randox,Crumlin,Co.，英國安特里姆，英國），這是一種半自動化生物芯片系統(tǒng)，設計用于研究、臨床應用和獸醫(yī)使用，實驗證明該多陣列生物芯片系統(tǒng)特異性非常令人滿意；驗證了六個抗生素殘基的檢測能力均低于歐盟參考實驗室（EU-RL）于2007年發(fā)布的參考方法所能測定的最低濃度，AMII試劑盒可以檢測至少六個喹諾酮類，四個四環(huán)素和三個差向異構體，三個氨基糖苷類，三個大環(huán)內(nèi)酯類，甲砜霉素，氟苯尼考和頭孢噻呋以及一種穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物二呋喃基頭孢呋喃半胱氨酸二硫化物（DCCD）。

4展望

得益于現(xiàn)代生物技術的迅速發(fā)展且動物源性食品本身就來源于動物體，利用某些生物材料（如酶、抗體、組織、細胞等）對抗生素物質(zhì)具有的特異性識別能力或靈敏響應能力檢測抗生素殘留，是近年來動物源性食品中抗生素檢測研究的熱點之一。

在免疫分析的諸方法中，放射免疫分析由于具有準確、靈敏的特點，至今使用仍較多。但放射性污染的弊端也是同樣明顯的。酶聯(lián)免疫分析是最先提出的非放射免疫方法，并在進入20世紀80年代后首次占據(jù)主導地位，且將在今后比較長的一段時間內(nèi)仍占主導地位，特別是在應用方面更將是如此。化學和生物發(fā)光免疫分析法，由于其高靈敏度和測定簡便的特點使其在免疫分析中始終占有一定的位置。自動化、大眾化、與其他技術的聯(lián)用是免疫分析的重要發(fā)展方向。

相對于物理、化學傳感器，所有生物傳感器，易受環(huán)境條件的影響，不夠穩(wěn)定，敏感元件使用壽命短，要經(jīng)常更換固定化生物膜。生物傳感器發(fā)展中的問題著微電子、分子生物學、計算機和材料等科學技術的發(fā)展，多種學科技術的相互交叉應用的推進，將會順利解決，而且將會有更多更好的各種用途的生物傳感器出現(xiàn)。未來生物傳感器將更趨向微型化、集成化、智能化。未來的生物傳感器將集合體積小、功能強、響應快、靈敏度高、選擇性好等特點，成為一種廣泛應用的高科技生物分析技術。

基因芯片技術不過短短幾年時間，其發(fā)展勢頭非常迅猛，在生命科學的各個領域得到普遍應用，但其存在的缺陷也顯而易見。首先是資本的問題，由于芯片制作的工藝龐大，信號檢測也需專門的儀器配置，普通實驗室難以負擔其高昂的用度；其次在芯片實驗技術上尚有多個問題需要解決，如探針合成等。

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