黑果腺肋花楸又名不老莓、野櫻莓，屬薔薇科植物。營(yíng)養(yǎng)豐富，果實(shí)中富含花青素、多酚以及黃酮等多種功能成分，具有抗炎、抗輻射、降血糖、保肝等功效，同時(shí)還可以清除機(jī)體自由基。果實(shí)既可生食，亦可加工制作保健飲料、果汁、果酒和果醬等食品，具有健脾理氣、益氣止咳的作用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)黑果腺肋花楸的研究極少，開發(fā)和利用其功能成分對(duì)以后的研究極其重要。

花色苷是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的水溶性的黃酮類天然色素，是由花青素與各種糖類形成的糖苷。其中95％的花色苷中均含有六種花青素，即天竺葵色素、矢車菊素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ?/span>和錦葵色素，通過強(qiáng)酸水解可將花青素轉(zhuǎn)化成6種常見花色素中的一種或幾種。花青素具有較強(qiáng)的抗氧化性，能夠清除人體內(nèi)的自由基，抑制肝脂質(zhì)的過氧化現(xiàn)象，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，能夠阻止活性氧對(duì)DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他生物大分子的損害，清除有害的自由基，因此具有預(yù)防心血管疾病，預(yù)防癌癥，緩解糖尿病，保護(hù)眼睛等功效，現(xiàn)在已經(jīng)被應(yīng)用到食品、藥品、保健品、化妝品等中。目前，尚未見關(guān)于黑果腺肋花楸提取物中氯化矢車菊素含量測(cè)定的報(bào)道。本文參照相關(guān)文獻(xiàn)，供試品溶液制備采用加熱回流酸化甲醇水解法，該工藝成熟且簡(jiǎn)單易于操作。采用HPLC法測(cè)定黑果腺肋花楸提取物中氯化矢車菊素的含量，為黑果腺肋花楸果的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

一、材料與方法

1、材料與試劑

黑果腺肋花楸提取物(吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制)；氯化矢車菊素(對(duì)照品，HPLC≥98％，成都曼思特生物科技有限公司)；甲醇、磷酸(色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑公司)；水為重蒸餾水；其余所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2、儀器與設(shè)備

LC-2000型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；W5-100SP型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；FA-2004N型電子分析天平(上海精密科學(xué)儀有限公司)；KQ250DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TU-1950雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；T-50溶劑過濾器(天津市實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；RE-52AA隔膜真空泵(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

3、方法

（1）黑果腺肋花楸提取物中氯化矢車菊素的HPLC含量測(cè)定方法

①色譜條件色譜柱為大連依利特ODS2C18(4.6ininx250mm，5um)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.2％磷酸水溶液(W)，程序?yàn)?～30min，40％A；流速：0.8mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20皿；檢測(cè)波長(zhǎng)為276am。

②對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的氯化矢車菊素對(duì)照品1.80mg，置于50mL的容量瓶中，用2％鹽酸甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.036mg.mL^-1的對(duì)照品溶液，置于冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

③供試樣品溶液的制備方法

稱取干燥至恒重的黑果腺肋花楸提取物1g，放入圓底燒瓶中，加入2％的鹽酸甲醇溶液30mL，置于90℃水浴中回流1h，冷卻至室溫，搖勻，過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中并用2％的鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(O.22μm)濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

④流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)中主要考察了甲醇-0.2％磷酸水溶液、乙腈-0.2％磷酸水溶液、甲醇-3％甲酸水溶液等各種流動(dòng)相對(duì)黑果腺肋花楸提取物中氯化矢車菊素保留時(shí)間和分離度的影響。

⑤線性關(guān)系考察

吸取氯化矢車菊素的對(duì)照品溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為3.6、7.2、14.4、21.6、28.8、36.0μg·／mL的系列對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定氯化矢車菊素的峰面積。以吸光度氯化矢車菊素的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=37486C+3.2127，R=0.9995(n=6)。結(jié)果表明氯化矢車菊素進(jìn)樣濃度在3.6～36.0μg·mL^-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

⑥重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)黑果腺肋花楸提取物6份，稱取干燥至恒重的黑果腺肋花楸提取物1g，放入圓底燒瓶中，加入2％的鹽酸甲醇溶液30mL，置于90℃水浴中回流1h，冷卻至室溫，搖勻，過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中并用2％的鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(O.22μm)濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。各進(jìn)樣量20μL，測(cè)定氯化矢車菊素的峰面積。氯化矢車菊素峰面積分別為602.18、612.34、616.52、621.13、629.28、613.52，RSD為1.54％，結(jié)果表明含量測(cè)定方法具有較好的重復(fù)性。

⑦儀器精密度試驗(yàn)

吸取對(duì)照品及供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20μL，分別測(cè)定對(duì)照品及供試品溶液中氯化矢車菊素的峰面積。供試品中氯化矢車菊素峰面積分別為624.23、623.84、631.37、645.85、623.59、611.80，RSD為1.79％。對(duì)照品中氯化矢車菊素峰面積分別為1065.54、1140.96、1122.17、1097.34、1093.65、1138.23，RSD為2.65％，結(jié)果表明儀器精密度符合要求。

⑧供試品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣20μL，測(cè)定氯化矢車菊素的峰面積。供試品中氯化矢車菊素峰面積分別為617.32、634.17、618.97、630.15、631.22、625.34，RSD為1.09％，表明供試品溶液在室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定，滿足測(cè)定要求。

⑨檢測(cè)限與定量限試驗(yàn)

吸取對(duì)照品溶液適量，逐步稀釋，直到檢測(cè)峰高為基線噪聲的3倍為止，計(jì)算氯化矢車菊素的最低檢測(cè)濃度，試驗(yàn)結(jié)果表明氯化矢車菊素的最低檢測(cè)限為0.360μg／mL。吸取對(duì)照品溶液適量，逐步稀釋，直到檢測(cè)峰高為基線噪聲的l0倍為止，計(jì)算氯化矢車菊素的定量限，試驗(yàn)結(jié)果表明氯化矢車菊素的定量限為0.144μg／mL。

(2)供試品溶液制備方法的優(yōu)化

①正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，基本定位了作用于花青素水解的三個(gè)要素，分別為水解溫度、反應(yīng)時(shí)間和酸濃度。選擇水解溫度、反應(yīng)時(shí)間、酸濃度作為考察因素，按三因素三水平進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平表見表1。

②工藝驗(yàn)證性試驗(yàn)

稱取黑果腺肋花楸提取物3份，每份0.5g，放入圓底燒瓶中，加入3％的鹽酸甲醇溶液15mL，置于100℃水浴中回流120min，冷卻至室溫，搖勻，過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中并用3％的鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.22μm)濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。色譜柱為大連依利特ODS2C18(4.6inin×250mm，5μm)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.2％磷酸水溶液(V/V)，程序?yàn)?～30min，40％A；流速：0.8mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm。分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定氯化矢車菊素的峰面積，計(jì)算氯化矢車菊素的平均含量及RSD值，確定正交試驗(yàn)所選取的水解條件的穩(wěn)定性。

聲明：本文所用圖片、文字來源《中國(guó)食品添加劑》，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系

相關(guān)鏈接：天竺葵色素，飛燕草色素，牽?；ㄉ?/a>，黃酮