3.3全式金試劑盒提取集聚性大腸桿菌基因組方法優(yōu)化

采用全式金細(xì)菌基因組DNA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)提取方法中革蘭氏陽性菌提取方法進(jìn)行集聚性大腸桿菌基因組的提取，并對提取方法改進(jìn)。

第一步材料處理。在菌液的重懸液中加入200μL RB11試劑（含溶菌酶4 mg）后在37℃的孵育時(shí)間由原來的1 h改為40min，加入蛋白酶K后在55℃的孵育時(shí)間由原來的15 min延長至30 min，洗脫后測定收集到溶菌酶裂解處理后的基因組DNA樣品的純度及濃度，見表6。由表可以看出，經(jīng)溶菌酶孵育處理后EAEC基因組DNA的提取量增大了近3倍。電泳分析結(jié)果如圖3所示。由圖可以看出，所提取的基因組條帶均一，無RNA污染。在提取過程中，加入試劑LB11與蛋白酶K經(jīng)55℃孵育30min后，菌液仍非常黏稠，因此推測EAEC菌體細(xì)胞成分較為復(fù)雜，可能是蛋白質(zhì)含量較高，加入的蛋白酶K未能完全消化菌體蛋白，導(dǎo)致裂解液非常黏稠，不利于后續(xù)基因組DNA的提取，后續(xù)實(shí)驗(yàn)提高蛋白酶K的用量至40 mg/L。

增大蛋白酶K的用量后，菌體裂解液黏稠度明顯降低，將其轉(zhuǎn)移到吸附離心柱中離心后，液體易于通過吸附膜，因此，為了提高基因組的濃度，取3倍體積菌體裂解液用于提取基因組。表7為提高蛋白酶K用量后提取集聚性大腸桿菌基因組的純度和濃度。由表可知，采用革蘭氏陽性菌基因組DNA提取方法并增大1倍蛋白酶K的用量后，集聚性大腸桿菌基因組的濃度達(dá)到了197.7 mg/L，較標(biāo)準(zhǔn)方法提取的基因組的濃度增大了約14.5倍，但基因組純度沒有提高，推測所提取的基因組中仍有蛋白質(zhì)等碳水化合物或無機(jī)鹽、有機(jī)試劑的污染。由于所提取的基因組DNA用于制備定性核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，因此模板DNA的純度對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增基因組的特征基因時(shí)影響較小。瓊脂糖凝膠電泳分析提高蛋白酶用量后的腸道集聚性大腸桿菌(EAEC)基因組結(jié)果如圖4所示。由圖可以看出，所提取的EAEC基因組條帶明顯，未見降解，無RNA污染，表明該優(yōu)化方法能有效提高基因組DNA的濃度。

3.4集聚性大腸桿菌毒力基因PCR擴(kuò)增檢測

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.6—2016的方法，對所提取的集聚性大腸桿菌基因組進(jìn)行檢測。以所提取的集聚性大腸桿菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增其特征基因astA、aggR、pic和uidA，并對其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖5所示。astA、aggR、pic基因?yàn)榧坌源竽c桿菌的特征毒力基因，uidA基因可在97%的大腸桿菌內(nèi)檢測到，4個(gè)基因的檢測結(jié)果均為陽性，PCR產(chǎn)物條帶大小與目的片段大小相符，說明所提取的基因組確為集聚性大腸桿菌基因組。盡管所提取基因組的純度指標(biāo)A260/A2 8 0和A260/A2 3 0均未達(dá)到1.8，但是根據(jù)毒力基因擴(kuò)增結(jié)果可知，所制備的基因組樣品對于定性核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測結(jié)果無影響，可用于制備定性核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品。

4結(jié)論

對比使用多種細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取EAEC基因組的提取效果可知，由于EAEC細(xì)胞裂解液非常黏稠，不利于后續(xù)的基因組提取，因此提取到的EAEC基因組的濃度及純度均非常低。4種試劑盒中全式金試劑盒提取步驟簡便，耗時(shí)少，因此對該試劑盒提取過程進(jìn)行優(yōu)化。通過增加30 min的溶菌酶孵育、1倍蛋白酶K的用量及2倍體積的菌體裂解液，EAEC基因組的提取濃度提高了14.5倍，以所提取的基因組為模板，PCR檢測EAEC的特征毒力基因，結(jié)果顯示3個(gè)特征毒力基因均為陽性，滿足用于制備食品檢測用核酸定性參考物質(zhì)的要求。本文中的研究為大量提取核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品的前期樣品奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為基因組提取困難的細(xì)菌基因組的提取方法探索提供了參考。

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