陳皮是蕓香科植物橘(Citrus reticulataBlanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮，屬于藥食兩用中藥，具有理氣健脾、燥濕化痰的作用。其化學(xué)成分以黃酮類為主，此外還含有檸檬苦素類、生物堿類、揮發(fā)油類及微量元素等，具有抗菌、抗病毒、抗突變、抗腫瘤、抗過敏等藥理作用。目前文獻(xiàn)報(bào)道多集中在其資源品質(zhì)、化學(xué)成分、含量分析及藥理方面，在食品方面的應(yīng)用主要是將其加工成各類形態(tài)、風(fēng)味特征的食品，如果醬、糕點(diǎn)、飲料等。研究表明，陳皮具有抗氧化作用，如Jiang X R等發(fā)現(xiàn)陳皮干浸膏對肉雞生長性能及免疫抗氧化能力具有影響；Liang S H等發(fā)現(xiàn)陳皮多糖對·OH有清除作用；王衛(wèi)東等發(fā)現(xiàn)陳皮黃酮具有較強(qiáng)抗氧化活性。而對于陳皮單體化學(xué)成分作為食品抗氧化劑的應(yīng)用研究很少。

油脂氧化易對油脂的風(fēng)味、色澤產(chǎn)生不良影響，是影響油脂品質(zhì)的一個(gè)重要因素，同時(shí)會(huì)對機(jī)體蛋白質(zhì)造成破壞，危害人體健康，在油脂中添加抗氧化劑是延緩油脂氧化最為有效的方法。油脂抗氧化劑按其來源可分為人工合成抗氧化劑和天然抗氧化劑，許多植物成分具有抗氧化性能，從中開發(fā)廣譜、高效、安全的天然抗氧化劑已成為當(dāng)今食品添加劑研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一。文獻(xiàn)報(bào)道多為茶葉、香辛料、中草藥提取物的抗氧化作用，活性成分主要為黃酮類、多酚類、皂甙類、鞣質(zhì)類、維生素類、褪黑素類等，涉及單體化合物的研究較少，尚需在有效成分的抗氧化機(jī)理、協(xié)同作用、構(gòu)效關(guān)系和分子設(shè)計(jì)等方面開展深入研究?；诓煌淖饔脵C(jī)理，抗氧化活性評價(jià)方法也多種多樣，自由基清除能力是最常用的體外抗氧化活性測定模型，其中，卜二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法具有操作簡單、方便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。而脂質(zhì)過氧化是一個(gè)產(chǎn)生自由基和自由基參與鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的過程，目前多采用亞油酸體系、卵黃脂蛋白體系、食用油體系、小鼠肝臟勻漿體系和小鼠紅細(xì)胞脂質(zhì)過氧化體系等進(jìn)行體外抗脂質(zhì)過氧化理論研究。

本實(shí)驗(yàn)首先采用石油醚、乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水四種不同極性的溶劑對陳皮粉進(jìn)行回流提取，得到相應(yīng)的提取物，研究它們在不同濃度下對DPPH自由基這種比較簡單的抗氧化模型的清除作用，確定抗氧化效果較好的提取物，以縮小進(jìn)一步活性篩選的范圍；然后將該提取物進(jìn)行柱層析初步分離得到不同極性的洗脫物，以抑制亞油酸過氧化作為活性篩選方法，得到效果較強(qiáng)的洗脫物；接著將該洗脫物進(jìn)行制備薄層層析法分離，以亞油酸過氧化及卵黃脂質(zhì)過氧化的抑制作用為進(jìn)一步活性篩選方法，得到活性較好的單體成分；最后測定該單體化合物在不同濃度下對DPPH、亞油酸過氧化、卵黃脂質(zhì)過氧化及食用油氧化的抑制作用并確定其結(jié)構(gòu)。以期逐步篩選得到效果較好的天然抗氧化劑，為其應(yīng)用于食品工業(yè)中提供理論參考。

一、材料與方法

1、材料與試劑

DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海恒科學(xué)儀器有限公司；DFY-XS00高效多功能粉碎機(jī)，溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司；HJ一6A數(shù)顯磁力攪拌電熱套，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；RE一52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ—DⅢ循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；YP3001N電子天平、JA2003N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司； TDL-409臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠WD一9403C紫外儀，北京市六一儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市英峪予華儀器廠；V-11OOD可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司l UV—vis 2550型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津一GL(上海)商貿(mào)有限公司；XT4A顯微熔點(diǎn)測定儀(控溫型)，北京科儀電光儀器廠；FTIR一840傅立葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；Avance AV500MHz型超導(dǎo)核磁共振儀，德國Bruker公司；Waters UPLC—SQD單四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，美國Waters公司。

陳皮，肇慶市邦健大藥房提供，肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室中心鑒定為蕓香科植物橘(Citrus reticulata Blanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮；食用級大豆油，山東魯花集團(tuán)有限公司；98％2，2一二苯基一1一苦味?；杂苫?，德國Meker公司；羧甲基纖維素鈉、GF254薄層層析用硅膠、100—200目柱層析用硅膠，青島海洋化工有限公司；三氯乙酸、亞油酸、卵磷脂、維生素C、硫代巴比妥酸、硫酸銅，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；石油醚、乙酸乙酯、氯仿、95％乙醇、無水乙醇、正丁醇，分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

2、實(shí)驗(yàn)方法

（1）各樣品的制備

①陳皮提取物的制備參考文獻(xiàn)方法

提?。簩㈥惼じ稍?、粉碎、過100目篩后依次用石油醚、乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水進(jìn)行提取，各提取液減壓蒸餾除去溶劑，烘箱50℃干燥，得到石油醚提取物(提取物1)、乙酸乙酯提取物(提取物2)、無水乙醇提取物(提取物3)和水提取物(提取物4)，觀察顏色外觀、稱重并計(jì)算得率，得率(％)=各提取物質(zhì)量／陳皮粉質(zhì)量×100％。測定它們在無水乙醇或蒸餾水中的溶解度，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

②洗脫物的制備

將抗氧化活性初篩較顯著的提取物進(jìn)行硅膠柱層析，梯度洗脫，收集不同梯度的洗脫液，減壓濃縮回收溶劑，剩余物轉(zhuǎn)移至小燒杯中，室溫?fù)]干溶劑后烘箱50℃干燥，得到洗脫物1～6，觀察顏色外觀、稱重并計(jì)算得率，得率(％)=各洗脫物質(zhì)量／相應(yīng)提取物質(zhì)量×100％。測定它們在無水乙醇中的溶解度。

③單體化合物的制備

抗氧化活性篩選較顯著的洗脫物用無水乙醇溶解，采用制備薄層層析法分離。將硅膠GF₂₅₄與0.5％羧甲基纖維素鈉水溶液(19∶3mL)混合均勻鋪在大玻璃板上，室溫晾干后105℃活化，點(diǎn)樣，石油醚／乙酸乙酯展開，紫外反射儀上觀察，將比較明顯的斑點(diǎn)刮下，無水乙醇溶解后過濾，濾液放在通風(fēng)櫥中緩慢揮發(fā)，有固體析出，過濾收集固體，得到化合物1～6，50℃烘箱干燥。觀察各化合物顏色外觀、稱重并計(jì)算得率，得率(％)=各化合物質(zhì)量／相應(yīng)洗脫物質(zhì)量×100％，測定它們在無水乙醇中的溶解度。

（2）抗氧化涪陛篩選實(shí)驗(yàn)

④清除DPPH活性測定提取物1、2和3用無水乙醇溶解，提取物4用蒸餾水溶解，首先確定各提取物的飽和濃度，為了便于比較，將四種提取物統(tǒng)一配制成較小飽和濃度值的儲(chǔ)備液，再用二倍稀釋法稀釋，選擇合適的測試濃度范圍，最終四個(gè)待測提取物溶液濃度取值分別為0．14、0.27、0.54、1.08和2.15mg／mL。以抗壞血酸(維生素C)為對照，清除DPPH活性測定方法：取1.0mL各待測溶液，加入3.0mL的4099／mL DPPH乙醇溶液混合，室溫避光反應(yīng)30min后于517nm下測定吸光值，計(jì)算其清除率，清除率(％)=(A₀一As)／A₀×100％，其中A₀為空白組吸光度，As為樣品組吸光度值。

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