枸杞（wolfberry，RW）為茄科枸杞屬植物，是我國傳統(tǒng)名貴中藥，自古以來一直把它作為滋補(bǔ)上品，主要含有枸杞多糖，胡蘿卜素等多種活性成分?！侗静菥V目》中記載枸杞“久服堅(jiān)筋骨，輕身不老，耐寒暑”。枸杞性甘味平，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，枸杞具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目、延緩衰老等眾多功效。

衰老是一種由多種因素引起的微妙而又復(fù)雜的生理現(xiàn)象，通常伴隨著生理功能的退化甚至衰竭，基于衰老的自由基學(xué)說，衰老與細(xì)胞的氧化損傷密不可分。枸杞作為天然的抗氧化劑，其抗氧化和抗衰老功能得到了廣泛的關(guān)注。近年來，枸杞功能性食品的研究和開發(fā)越來越深
入，特別是枸杞作為抗氧化食品的開發(fā)，已成為枸杞加工業(yè)研究的熱點(diǎn)。

美拉德反應(yīng)是一種在食品加工過程中廣泛存在的非酶褐變反應(yīng)，主要是指還原糖與氨基酸、蛋白質(zhì)之間的復(fù)雜反應(yīng)。美拉德反應(yīng)除了能改善食品感官品質(zhì)，如色澤和風(fēng)味外，研究表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的類黑精具有一定的抗氧化特性，這為尋找和應(yīng)用天然抗氧化劑提供了新的思路。

盡管枸杞和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物均有抗氧化作用，且具備一定的理論基礎(chǔ)，但兩者結(jié)合后的產(chǎn)物是否會(huì)有更好的效果，目前仍未見報(bào)道。所以，本實(shí)驗(yàn)采用美拉德反應(yīng)原理，制備一種褐變黑枸杞新產(chǎn)品，以黑腹果蠅為實(shí)驗(yàn)對象，深入探究褐變黑枸杞（brownblackwolfberry，BBW）的抗氧化作用，從而為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1、材料與儀器

枸杞由寧夏早康科技有限公司提供，黑腹果蠅，由天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品添加劑與功能配料實(shí)驗(yàn)室提供；玉米粉、酵母粉，購自濱海新區(qū)明耀超市；無水葡萄糖、瓊脂粉，購于天津江天化工有限公司；對羥基苯甲酸乙酯，購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司；沒食子酸、蘆丁、福林酚試劑，購于北京索萊寶生物有限公司；過氧化氫酶（CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（測分型）、考馬斯亮藍(lán)試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

HWS-850智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；MultiskanFC酶標(biāo)儀，美國ThermoFisher公司；UVmini-1240紫外/可見分光光度計(jì)，日本島津儀器公司；MyiQ2實(shí)時(shí)定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司。

2、實(shí)驗(yàn)方法：

（1）褐變黑枸杞的制備

以寧夏枸杞為原料，在75%相對濕度和700C條件下放置6d，再在450C的鼓風(fēng)烘箱中干燥定型。干燥風(fēng)速0.5m/s，干燥時(shí)間60min即可。得到的褐變黑枸杞在溫水中浸泡、打漿、離心、取上清液，濃縮備用。

（2）褐變黑枸杞中總黃酮、總酚和褐變指數(shù)的測定

黃酮類化合物的測定參照SZDB/Z349--2019《黃酮類化合物的測定》中紫外分光廣度法；多酚的測定采用福林酚法；褐變指數(shù)的測定參照Xia等的方法，從褐變黑枸杞和紅枸杞中提取分子量（＞10kDa）的蛋白黑素，在420nm處測量的OD值作為吸光度。

（3）褐變黑枸杞中主要酚類物質(zhì)的測定

采用高效液相色譜法。檢測條件：色譜柱：C18（250mm×4.6mm，5μm，）；流動(dòng)相A：2%甲酸；流動(dòng)相B：乙腈；柱溫35～40C；進(jìn)樣量20uL；流速：0.8mL/min；檢測波長：280nm；檢測器為SPD紫外檢測器，用前過0.45μm膜，脫氣，洗脫程序如表1所示。

（4）果蠅的培養(yǎng)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：玉米粉72g，無水葡萄糖72g，瓊脂6g，酵母粉10g，40mL防腐劑（1%對羥基苯甲酸乙酯的75%乙醇溶液），750mL蒸餾水。給藥培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別按照終濃度3mg/mL、12mg/mL添加相應(yīng)劑量的褐變黑枸杞和紅枸杞。

（5）果蠅壽命實(shí)驗(yàn)

收集2d齡的雄、雌性果蠅各1000只，平均分為5組，分別培養(yǎng)在含有0、3、12mg/mL褐變黑枸杞和紅枸杞的培養(yǎng)基內(nèi)，每組10管，每管20只，給藥劑量的選擇參照劉玉荷等研究結(jié)果，在多次試驗(yàn)的基礎(chǔ)上最終確定。在250⁰C、相對濕度50%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中，每3d更換新的培養(yǎng)基，同時(shí)觀察果蠅生存，狀況并記錄，直至果蠅全部死亡，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)。最后統(tǒng)計(jì)果蠅的平均壽命、半數(shù)死亡壽命和最高壽命（各組最后20只死亡果蠅的天數(shù)平均數(shù)）。

（6）果蠅急性實(shí)驗(yàn)

收集2d齡雄、雌性果蠅各1000只，每組200只，采用高效液相色譜法。檢測條件：色譜柱：C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相A：2%甲酸；流動(dòng)相B：乙腈；柱溫35～40⁰C；進(jìn)樣量20uL；流速：0.8mL/min；檢測波長：280nm；檢測器為SPD紫外檢測器，用前過0.45μm膜，脫氣，培養(yǎng)25d后，饑餓2h，CO2麻醉后導(dǎo)入無培養(yǎng)基的干凈果蠅試管中，將沾有含30%H2O2的6%葡萄糖水溶液的濾紙條放入試管，保證濾紙條全部浸潤但不會(huì)有液體流下，每2h記錄果蠅死亡數(shù)，直至果蠅全部死亡。

（7）果蠅抗氧化酶活測定

收集2d齡的雌、雄性果蠅各1000只，每組200只，采用高效液相色譜法。檢測條件：色譜柱：C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相A：2%甲酸；流動(dòng)相B：乙腈；柱溫35～40⁰C；進(jìn)樣量20uL；流速：0.8mL/min；檢測波長：280nm；檢測器為SPD紫外檢測器，用前過0.45μm膜，脫氣，培養(yǎng)45d后，禁2h，CO2麻醉后稱重，-800C備用。果蠅和生理鹽水1∶49（m/m）冰上勻漿，4⁰C，2500r/min離心，收集上清液測定蛋白濃度，T-SOD、CAT活力及MDA含量。

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