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亞鐵離子等過渡態(tài)金屬離子可催化機體中的Fenton反應，引發(fā)脂質過氧化并產生羥基自由基，螯合亞鐵離子能力是評估受試物抗氧化活性的常用方法之一。不同提取方法對銀杏蛋白螯合亞鐵離子能力的影響如圖4所示。三種銀杏蛋白均表現出較好的亞鐵離子螯合能力，且與質量濃度呈正相關。在質量濃度為2.0g/L時，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對亞鐵離子的螯合率分別為21.78%±0.78%、12.92%±0.46%和18.78%±0.58%，而質量濃度增加至8.0g/L時，螯合率分別提高到68.54%±3.01%、67.68%±3.21%和73.28%±3.45%。在低質量濃度時，三種銀杏蛋白對亞鐵離子螯合能力的順序為WEAP＞UA-AEAP＞AEAP；而當質量濃度超過3.0g/L時，UA-AEAP的螯合能力則高于WEAP和AEAP。銀杏蛋白對亞鐵離子的螯合能力可能是因為氨基酸殘基中的羧基等基團與亞鐵離子發(fā)生了配位反應。UA-AEAP蛋白具有更強的亞鐵離子螯合能力，可能是因為超聲處理能夠降低銀杏蛋白聚集體的粒度，暴露出更多功能基團。許晶等研究表明，超聲預處理也可顯著提高大豆蛋白對亞鐵離子的螯合能力。
某種受試物的IC50低于10g/L，則說明該受試物具有一定的抗氧化能力。利用Origin2018對圖4數據進行非線性曲線擬合，得到WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對DPPH自由基清除能力的對數曲線方程分別為y=-31.56+43.32ln（x+0.1.63），R2=0.9735，y=-57.88+53.008ln（x+2.15），R2=0.9719和y=-16.92+41.33ln（x+0.73），R2=0.9662。根據R2可知，擬合優(yōu)度較好，由上述方程計算得出WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對亞鐵離子螯合能力的IC50分別為4.94、5.48和4.32g/L。由IC50可知，三種銀杏蛋白對亞鐵離子的螯合能力順序為UAAEAP＞WEAP＞AEAP。陽性對照的IC50為0.09g/L，提示EDTA具有極強的螯合亞鐵離子的能力。
DPPH自由基清除能力是評估受試物抗氧化潛力的最常用方法之一，當DPPH自由基被受試物清除時，DPPH溶液的吸光度會降低，因此可用于評估受試物的清除自由基能力。不同提取方法對銀杏蛋白清除DPPH自由基能力的影響如圖5所示。在0.05～6g/L的質量濃度范圍內，三種銀杏蛋白的DPPH自由基清除率均與質量濃度呈正相關。當質量濃度為1g/L時，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對DPPH自由基的清除率分別為42.61%±2.14%、41.63%±3.23%和50.47%±1.95%；當質量濃度升高至為5g/L時，清除率分別提高到70.45%±2.36%、68.78%±2.56%和74.92%±2.28%。與WEAP和AEAP蛋白相比，UA-AEAP蛋白具有更強的DPPH自由基清除能力，可能的原因是超聲處理能降低銀杏蛋白的聚集度，暴露出更多的與自由基作用的基團。Ma等研究表明，超聲處理可提高β-乳球蛋白對DPPH自由基的清除能力，這與本研究的結果相一致。
WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對DPPH自由基清除能力的對數曲線方程分別為y=37.69+19.31ln（x+0.11），R2=0.9931，y=34.36+19.86ln（x+0.15），R2=0.9911和y=45.54+17.79ln（x+0.04），R2=0.9954。由上述方程計算得出WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對DPPH自由基能力的IC50分別為1.78、2.05和1.24g/L，表明這三種銀杏蛋白均具有較高的清除DPPH自由基能力，清除能力順序為UAAEAP＞WEAP＞AEAP?？箟难岬腎C50為0.08g/L，提示抗壞血酸具有極強的清除DPPH自由基能力。
羥基自由基被認為是目前已知的氧化能力最強和危害性最大的活性氧之一，可通過電子轉移、加成和脫氫作用攻擊機體內多種生物分子，從而導致蛋白質、核酸和脂質的氧化損傷。圖6為不同提取方法對銀杏蛋白清除羥基自由基能力的影響。由圖可知，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對羥基自由基的清除活性與蛋白質量濃度呈正相關。在質量濃度為1.0g/L時，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對羥基的清除率分別為25.5%±0.82%、22.56%±0.74%和28.62%±1.21%；當質量濃度增加至8.0g/L時，清除率分別為73.96%±2.73%、68.52%±2.64%和78.94%±2.95%。由此可知，UA-AEAP蛋白具有更強的羥基自由基清除能力，這與前人研究結果相一致，大豆球蛋白經超聲預處理后對羥基自由基的清除能力顯著增強。銀杏蛋白對羥基自由基的清除能力可能是因為氨基酸殘基中的羧基等基團通過螯合亞鐵離子而阻斷Fenton反應，從而降低羥基自由基的產生。
WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對羥基自由基清除能力的對數曲線方程分別為y=10.25+28.13ln（x+0.80），R2=0.9944，y=6.01+27.64ln（x+0.79），R2=0.9946和y=17.76+27.40ln（x+0.49）,R2=0.9904，計算出IC50分別為3.31、4.12和2.76g/L，由此可知，三種銀杏蛋白對羥基自由基清除能力的順序為UA-AEAP＞WEAP＞AEAP。抗壞血酸的IC50為0.80g/L，表明抗壞血酸具有極強的清除羥基自由基能力。
不同提取方法對銀杏蛋白得率的影響較大，其中UA-AEAP蛋白得率最高，達11.36%±0.10%，顯著高于WEAP和AEAP。三種提取方法制備的銀杏蛋白純度均較高，可以滿足功能特性分析的需要。銀杏蛋白溶解度受到提取方法的影響，UA-AEAP蛋白的溶解度最高，WEAP蛋白的溶解度略高于AEAP蛋白。提取方法顯著影響了銀杏蛋白的起泡性、泡沫穩(wěn)定性和乳化性等功能特性，而對乳化穩(wěn)定性無顯著性影響；UA-AEAP蛋白的起泡性、泡沫穩(wěn)定性和乳化性均優(yōu)于AEAP和WEAP蛋白。提取方法影響了銀杏蛋白的抗氧化活性，銀杏蛋白的螯合亞鐵離子能力、清除DPPH自由基能力和清除羥基自由基能力的順序均為：UA-AEAP＞WEAP＞AEAP。綜上所述，UA-AEAP蛋白得率高、抗氧化能力和功能特性優(yōu)于另外兩種方法，更適于銀杏蛋白的制備。本研究考察了提取方法對銀杏蛋白功能特性及抗氧化活性的影響，為銀杏蛋白在食品體系中的應用及功能性產品的開發(fā)提供了理論基礎，后續(xù)將進一步研究不同提取方法對銀杏蛋白氨基酸組成、二級結構、亞基組成、分子構象等結構的影響。
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建立了高效液相色譜法同時快速測定銀杏葉及其提取物中蘆丁、槲皮素、山奈酚和異鼠李素4種游離黃酮含量的方法。通過分析原料及提取物之間對應各游離黃酮含量關系，評價了市面上部分銀杏葉提取物中游離黃酮含量水平，為銀杏原料采購及銀杏葉提取物質量判斷提供一定的理論依據，以期更好的為生產提供服務。
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