2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合點數(shù)

梔子黃對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合點數(shù)n如表3所示，隨著溫度的變化，兩種淀粉消化酶的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合點數(shù)都發(fā)生了一定的變化，側(cè)面反映了溫度是梔子黃對兩種酶作用的重要因素，隨著溫度的升高，α-淀粉酶的Ka值下降，表明了梔子黃對α-淀粉酶的作用隨著溫度的升高，其親和力下降。而α-葡萄糖苷酶隨著溫度的升高其與梔子黃的親和力逐漸上升（30～37℃之間）。n值略大于1說明了梔子黃對于兩種消化酶的作用可能有著超過一個或者一類的結(jié)合位點。也從數(shù)據(jù)可以看出在37℃的條件下α-葡萄糖苷酶的Ka大于α-淀粉酶，表明α-葡萄糖苷酶與梔子黃的親和力在同等條件下大于α淀粉酶，與之前抑制動力學(xué)結(jié)果類似。

2.4 熱力學(xué)參數(shù)計算

熱力學(xué)分析為了確定在上述基礎(chǔ)上梔子黃與淀粉消化酶相互作用的主因。表4計算了α-淀粉酶的ΔH和ΔS的值為分別-43.22，-34.01kJ/mol；α-葡萄糖苷酶ΔH和ΔS分別為234.882，0.874kJ/mol?？梢愿鶕?jù)表5中ΔH、ΔS取值情況推導(dǎo)出配體和生物分子之間作用力類型。結(jié)果表明，梔子黃與淀粉消化酶（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）的ΔG均為負(fù)值，表明結(jié)合過程是自發(fā)發(fā)生的。如表5所示，范德華力是梔子黃-α-淀粉酶相互作用過程中的主要驅(qū)動力。疏水作用力是梔子黃-α-葡萄糖苷酶相互作用過程中的主要驅(qū)動力。

2.5 同步熒光測量

由圖可知，隨著梔子黃的加入α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的兩種氨基酸殘基發(fā)生熒光猝滅，當(dāng)Δλ=15nm時，α-淀粉酶的酪氨酸殘基最大發(fā)射波長從297nm藍(lán)移至284nm。α-葡萄糖苷酶的酪氨酸殘基最大發(fā)射波長從292nm藍(lán)移至287nm。藍(lán)移和紅移分別代表熒光載體（Tyr和Trp）周圍疏水性和極性環(huán)境的增強?？赡苡捎跅d子黃與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶相互作用，引發(fā)酶的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致兩種淀粉消化酶酪氨酸殘基疏水性增加，所處微環(huán)境的極性有所減弱。當(dāng)Δλ=60nm時，可明顯看出α-淀粉酶的色氨酸殘基最大發(fā)射波長從287nm紅移至290nm，而α-葡萄糖苷酶的色氨酸殘基變化不大，該結(jié)果闡明了α-淀粉酶因梔子黃的加入使色氨酸殘基所處微環(huán)境的極性，也一定程度反映了隨著在梔子黃加入對α-淀粉酶酪氨酸殘基和色氨酸殘基附近都會產(chǎn)生構(gòu)象的變化，而梔子黃對α-葡萄糖苷酶的影響主要是在酪氨酸殘基附近。

2.6 梔子黃與淀粉消化酶結(jié)合距離計算

梔子黃與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合距離見表6。從表6可以看出梔子黃與α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合距離r分別為4.77nm和5.19nm，均小于8nm，且都滿足0.5R0＜r＜1.5R0的條件，表示梔子黃與兩種淀粉消化酶之間可以發(fā)生相互作用且極可能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。

3 結(jié)論

梔子黃通過競爭性抑制的方式能顯著抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的活性。相比于α-淀粉酶，梔子黃對α-葡萄糖苷酶的親和力可能更高。梔子黃通過自發(fā)的范德華力、疏水作用力分別對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶發(fā)生相互作用。梔子黃能夠引起兩種酶氨基酸殘基的構(gòu)象改變，主要作用兩種酶的酪氨酸殘基和色氨酸殘基。非輻射能量轉(zhuǎn)移在梔子黃與兩種消化酶之間發(fā)生概率很大，進(jìn)一步印證了梔子黃與兩種消化酶相互作用的可能性。該研究表明梔子黃可能對糖尿病患者癥狀改善具有積極的作用，這為篩選淀粉消化酶抑制劑及相關(guān)功能食品的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

相關(guān)鏈接：α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶，梔子黃，酪氨酸

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