糖尿病是一種多病因綜合作用導致的代謝性疾病，其特點是慢性高血糖，伴隨因胰島素分泌不足和（或）作用障礙引起的糖、脂肪、蛋白質代謝紊亂。世界衛(wèi)生組織將糖尿病主要分為兩類：Ⅰ型糖尿病，主要原因是胰腺β-細胞遭到破壞，導致血漿胰島素水平低下；Ⅱ型糖尿病，是一種非感染性慢性代謝綜合征，其特點是胰島素分泌受損和靶組織對胰島素作用的抵抗而導致的高血糖。據統(tǒng)計，Ⅱ型糖尿病是世界范圍內最常見的糖尿病，占所有糖尿病患者的90%以上，被認為是主要的公共衛(wèi)生問題。預計2030年糖尿病將成為人類第七大致死因素，被公認為“無聲殺手”。預計到2035年，受影響的人數將增加到5.92億。世界衛(wèi)生組織最近公布的統(tǒng)計數據顯示，全世界大約有15億成年人超重和肥胖，這使他們具有患糖尿病的潛在風險。

在食物消化過程中，淀粉被α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶共同作用水解成單糖，抑制這些酶的活性可顯著降低餐后血糖升高。抑制淀粉水解和葡萄糖的吸收是預防Ⅱ型糖尿病的有效途徑。近些年來，膳食活性成分在預防慢性疾病中的作用受到廣泛關注。據統(tǒng)計，目前有800余種植物提取物可能對糖尿病的治療起積極的作用。關于植物提取物作為淀粉消化酶抑制劑的研究成為熱點。梔子是我國治療糖尿病傳統(tǒng)藥物，是一種含有多種有效活性成分的藥食兩用資源，具有抗炎、抗氧化、保護神經等多種藥理作用。肖小華等報道梔子黃含量為1.67g/mg時能顯著降低不同糖負荷的小鼠血糖，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)梔子提取物對α-葡萄糖苷酶產生抑制作用的有效部分可能是環(huán)烯醚萜和梔子黃色素類。Zhou等通過研究梔子對治療Ⅱ型糖尿病的動物實驗糞便組學從側面證實了梔子黃的降糖效果。李春英等報道梔子黃抑制α-葡萄糖苷酶活性，然而，具體作用機制不詳。本研究探討梔子黃對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的影響及其作用動力學，通過光譜特征分析兩種淀粉消化酶結構變化，揭示梔子黃對餐后血糖升高的抑制作用機制，以期為糖尿病患者功能產品的開發(fā)提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子黃（色價500），河南中大恒源生物科技有限公司；小麥淀粉（含水量12.89%），泰州市好食惠調味品有限公司；α-淀粉酶（50U/mg），美國Sigma公司；α-葡萄糖苷酶（7000000U/mL），上海源葉生物科技有限公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷（PNPG），麥克林生化科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸，國藥集團化學試劑有限公司。其余試劑均為分析純，天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1600B紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；FA1004電子分析天平，上海上平儀器公司；MultiskanFC96孔酶標儀，賽默飛世爾儀器有限公司；G9800A熒光分光光度計，安捷倫科技有限公司；MVS-1旋渦混合器，北京金北德工貿有限公司；SHZ-82數顯水浴恒溫振蕩器，金壇華峰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 梔子黃對α-淀粉酶抑制動力學研究

使用米氏方程（Michaelis-Menton）和LineweaverBurk方程確定梔子黃對α-淀粉酶的抑制方式。以小麥淀粉溶液作底物磷酸鹽緩沖液溶解后在80℃的水浴鍋中糊化30min。淀粉質量分數為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%。梔子黃溶液質量濃度定為0.5，0.7mg/mL。向具塞試管中先加入不同濃度梔子黃溶液250μL，再添加250μLα-淀粉酶溶解液37℃振蕩10min，再加入500μL不同濃度的底物溶液，每隔5min取出相對應的試管并加入2.0mLDNS顯色劑沸水中加熱5min后冷卻至室溫，定容至25mL，540nm處測量其吸光度。

1.3.2 梔子黃對α-葡萄糖苷酶抑制動力學研究

α-葡萄糖苷酶與α-淀粉酶的試驗方法大致相同。梔子黃溶液濃度仍然為0.5，0.7mg/mL，試驗中需要將作為底物的PNPG溶液的濃度范圍設定為0.5～5.0mmol/L。向96孔酶標板中先加入80μL磷酸鹽緩沖溶液按設定加入20μL不同濃度的梔子黃溶液和60U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，37℃氣浴振蕩10min后加入20μLPNPG底物溶液，每隔5min取出酶標板并加入100μL的0.2mol/L的碳酸鈉溶液終止反應，用96孔酶標儀在405nm處測定吸光度。具體的方程計算情況與上述的α-淀粉酶的過程相一致。

1.3.3 α-淀粉酶熒光光譜測定

探究不同濃度梔子黃對α-淀粉酶的熒光猝滅光譜。在磷酸鹽緩沖液中配置質量濃度0.025，0.1，0.3，0.5，0.7，1mg/mL的梔子黃；將α-淀粉酶（300U/mL）溶解到pH6.8的磷酸鹽緩沖液中，在3mL的α-淀粉酶的溶液中加入0.2mL不同濃度的梔子黃漩渦振蕩2min定容至10mL。將混合液分別在30℃和37℃的水浴條件下恒溫振蕩30min。以等量的梔子黃溶液為空白參比，激發(fā)波長278nm，發(fā)射波長290nm，狹縫寬度5nm，在290～500nm波長范圍內進行熒光發(fā)射光譜掃描。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶熒光光譜分析

α-葡萄糖苷酶熒光光譜分析與α-淀粉酶類似，其中α-葡萄糖苷酶的酶活力大小為180U/mL激發(fā)波長278nm，發(fā)射波長290nm，狹縫寬度5nm，在290～450nm波長范圍下進行熒光發(fā)射光譜掃描。其中的對照試驗與上述α-淀粉酶的方法與操作相同。

同步熒光光譜試驗與1.3.3節(jié)過程大致相同，在上述熒光猝滅試驗基礎上，將參數改變?yōu)椋?alpha;-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶均在波長200～400nm范圍內，通過設定激發(fā)波長間隔和發(fā)射波長間隔在△λ=15～60nm的設定下進行熒光光譜掃描。
酶的抑制動力學可以通過以下方程表示：

Michaelis-Menton方程：

不同I下的雙倒數直線得出斜率Slope。利用I和Slope再次作圖得出K_ic。方程如下：

將斜率（Slope）或截距（Y-intercept）與I的二次重繪圖并進行線性擬合。式（1）、（2）、（3）、（4）中：V—初始反應速度，mg/mL/min；S—底物質量濃度，mg/mL；V_max—最大初始反應速度，mg/mL/min；I—抑制劑質量濃度，mg/mL；α—表觀系數；Km—米氏常數；K_ic—競爭性抑制常數；Kiu—非競爭性抑制常數。

熒光猝滅通過Stern-Volmer方程描述：

式（5）中：F₀和F—分別為不存在和存在猝滅劑時熒光物質的熒光強度；Ksv和Kq—分別為Stern-Volmer猝滅常數和受擴散過程控制的雙分子熒光猝滅速率常數；[Q]—猝滅劑質量濃度，mg/mL；τ₀—熒光分子平均壽命（α-淀粉酶的τ₀為2.97ns，α-葡萄糖苷酶的τ₀為10^-8s）。

相關鏈接：α-葡萄糖苷酶，α-淀粉酶，梔子黃，5-二硝基水楊酸

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