1.3.5 溶解性的測(cè)定

參照Garcia等的方法對(duì)蛋白溶解性進(jìn)行測(cè)定，將TSG和大豆分離蛋白溶于去離子水中配置成50mg/mL溶液，用2mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值，于室溫下攪拌30min后以4000r/min離心30min，取上清液于280nm波長下測(cè)定紫外分光光度值。

式中：m₁—上清液蛋白質(zhì)含量，g；m₂—總蛋白質(zhì)的含量，g。

1.3.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參照Garcia等的方法對(duì)蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。將TSG和大豆分離蛋白溶于去離子水中配置成質(zhì)量濃度為10mg/mL的溶液，使用2mol/L的HCl和NaOH對(duì)其pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，加入等體積大豆油，10000r/min高速剪切2min，4000r/min離心15min，測(cè)量乳化層體積，液體總體積及30min后乳化層體積。并用如下公式計(jì)算乳化性和乳化穩(wěn)定性。

式中：V₁—乳化層體積，mL；V₂—30min后乳化層體積，mL；V₃—液體總體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子質(zhì)量

采用SDS-PAGE電泳法，以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照組，對(duì)TSG的分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。圖中最左側(cè)條帶為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，條帶1為上樣質(zhì)量濃度8mg/mL的TSG。由圖可知，TSG主要由11個(gè)亞基條帶組成，分布在10～70ku，屬于低分子質(zhì)量蛋白，其中最主要亞基分布在35.34ku及13.83ku兩處，其表達(dá)量顯著高于其它分子質(zhì)量的條帶。蛋白質(zhì)的亞基組成及大小能夠影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。種子球蛋白普遍包含堿性亞基及酸性亞基，分子質(zhì)量分別在20～27ku及30～39ku內(nèi)，其中酸性亞基有利于蛋白溶解性的提高，這主要是由于酸性亞基的結(jié)構(gòu)疏松，有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的伸展及親水基團(tuán)的暴露，從而提高蛋白質(zhì)的溶解性。而堿性亞基則有利于蛋白持油性的提高，降低蛋白的起泡能力，這可能與堿性亞基的疏水基團(tuán)較多有關(guān)。蛋白亞基的大小及酸性亞基和堿性亞基的比例對(duì)蛋白溶解性、起泡性、乳化性等功能特性造成一定的影響進(jìn)而影響其在食品工業(yè)中的生產(chǎn)應(yīng)用，如：蛋白質(zhì)亞基組成及大小的不同會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)局部厚度不同，致使網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)密度形成差異，蛋白大分子亞基含量的減少，有利于蛋白溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性的提高，進(jìn)而影響產(chǎn)品營養(yǎng)及加工品質(zhì)。因此，了解蛋白的亞基組成、大小及亞基與蛋白功能特性的關(guān)系可為蛋白的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)指導(dǎo)。

2.2 巰基的二硫鍵含量

采用DTNB比色法，探究中性條件下TSG中總巰基、游離巰基及二硫鍵含量，結(jié)果如表1所示。

巰基是蛋白質(zhì)中最具活性的官能團(tuán)，可改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)而致使蛋白質(zhì)功能特性發(fā)生改變，巰基發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生的二硫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象重要的共價(jià)鍵，其可使肽鏈的空間結(jié)構(gòu)更緊密，有助于維持蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)，因此，二硫鍵含量高的蛋白質(zhì)其結(jié)構(gòu)更趨于穩(wěn)定。此外，巰基和二硫鍵具有較高的生物活性，含量高時(shí)能顯著改善蛋白的結(jié)構(gòu)及表面疏水性、溶解度、乳化性和起泡性，其中表面疏水性與游離巰基含量呈線性正相關(guān)，這可能是由于隨著游離巰基含量的增加，蛋白質(zhì)解折疊及疏水性殘基的暴露，導(dǎo)致蛋白表面疏水性增強(qiáng)所致。二疏鍵則在乳化凝膠形成過程中對(duì)脂肪的穩(wěn)定起決定作用，由表1可知，TSG中游離巰基含量為（33.97±2.94）μmol/g，二硫鍵含量為（44.08±3.79）μmol/g，TSG中巰基及二硫鍵含量均較高，因此功能性質(zhì)良好，在食品工業(yè)上有極大的開發(fā)利用價(jià)值。

2.3 氨基酸

采用PITC柱前衍生氨基酸分析法對(duì)TSG的氨基酸組成及含量進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。由表可知TSG氨基酸種類組成較齊全，總氨基酸含量為528.17mg/g，其中必需氨基酸含量占總氨基酸含量（E/T）的45.85%，必需氨基酸/非必需氨基酸（E/N）比值為0.85，均顯著高于FAO/WHO理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中人體必需氨基酸含量/氨基酸總含量（40%）及人體必需氨基酸含量/非必需氨基酸（0.6）標(biāo)準(zhǔn)值。在8種必需氨基酸中，異亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸及蘇氨酸含量最為豐富，其中異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸均高于FAO中推薦值（異亮氨酸含量4.0%，苯丙氨酸含量6.0%、蘇氨酸含量4.0%）。但TSG中缺少含硫氨基酸——蛋氨酸，推測(cè)可能是由于酸水解作用導(dǎo)致氨基酸損失所致。此外田琨等研究表明豆科植物中缺乏蛋氨酸，因此蛋氨酸的缺少也可能與TSG提取原料有關(guān)。含硫氨基酸中除蛋氨酸外還包括半胱氨酸和胱氨酸，是蛋白質(zhì)中巰基和二硫鍵的主要來源，二者可通過氧化還原而互變。TSG中胱氨酸的含量約占總氨基酸含量的5.89%，而青稞蛋白和大豆分離蛋白中僅為1.51%，1.30%，胱氨酸含量的高低直接影響巰基及二硫鍵的含量，因而致使TSG巰基和二硫鍵含量較高。

2.4 溶解性

以大豆分離蛋白為對(duì)照組，對(duì)相同質(zhì)量濃度不同pH值條件下大豆分離蛋白和TSG的溶解性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。由圖可知，隨著pH值的升高，TSG和大豆分離蛋白的溶解性均呈現(xiàn)先升高后降低而后逐漸平穩(wěn)升高的趨勢(shì)。在極端酸性條件pH2.5到等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解性發(fā)生驟降且在等電點(diǎn)附近時(shí)達(dá)到最小，其中TSG溶解性從（87.66±4.87）%降低到（12.58±0.97）%，大豆分離蛋白從（94.96±3.97）%降低到（13.07±0.85）%。隨后越偏離等電點(diǎn)，TSG及大豆分離蛋白的溶解度越高，pH值到8.5以后，溶解度趨于穩(wěn)定上升。由于食品加工過程中不涉及極端酸堿的處理，因此本文著重對(duì)pH4.0～10.0范圍內(nèi)TSG及大豆分離蛋白的溶解性進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)TSG在pH4.0～10.0條件下的溶解性優(yōu)于大豆分離蛋白，在中性條件pH7.0時(shí)TSG溶解性為（76.74±2.76）%，比大豆分離蛋白高26.9%。

蛋白質(zhì)的溶解度能夠顯著影響其它功能特性，因此常被作為評(píng)價(jià)其加工價(jià)值的重要參數(shù)。由于蛋白質(zhì)具有兩親性，因此其溶解度常受到溶液pH值環(huán)境及離子強(qiáng)度的影響。當(dāng)溶液pH值處于蛋白質(zhì)自身等電點(diǎn)時(shí)，蛋白所帶電荷數(shù)最少，與水分子的作用最弱，此時(shí)蛋白質(zhì)分子間的相互作用力增強(qiáng)，更易發(fā)生蛋白質(zhì)聚集，因而溶解度最低；而在小于或高于等電點(diǎn)的pH值范圍時(shí)，蛋白質(zhì)正、負(fù)電荷不平衡，蛋白質(zhì)同水分子的結(jié)合能力增強(qiáng)，溶解度隨之增加。蛋白質(zhì)的氨基酸種類也是影響其親水性/疏水性平衡及溶解度的重要因素，疏水氨基酸如亮氨酸、異亮氨酸等可通過疏水鍵相互結(jié)合在蛋白質(zhì)中心形成疏水區(qū)域；親水氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸等則可與水分子形成位于蛋白外側(cè)的親水區(qū)域。可見蛋白質(zhì)中親/疏水程度的差異使其呈現(xiàn)出不同的溶解性，TSG的親水性氨基酸含量為54.98%，大豆分離蛋白親水性氨基酸含量為46.70%，這是TSG蛋白溶解性高于大豆分離蛋白的主要原因。

相關(guān)鏈接：氨基酸，異亮氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸

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