1.3.3 GBRG降血糖作用研究

1.3.3.1 各組分GBRG對α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

將各組分GBRG配成0.5mg/mL的溶液，取0.60mL磷酸緩沖液（0.05mol/LpH6.8）和0.20mLα-葡萄糖苷酶酶液（0.2U/mL）與0.10mL各組分GBRG液分別進行混合，作為待測樣品，將樣品37℃水浴10min后，加入20mmol/L的PNPG溶液0.20mL。5min后加入1mL1mol/L的Na2CO3溶液終止反應。對照組為阿卡波糖，405nm處測定其吸光值，并計算各組分GBRG對α-葡萄糖苷酶的抑制率，篩選出抑制α葡萄糖苷酶的活性最顯著的糖蛋白組分進行后續(xù)研究。

1.3.3.2 具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的GBRG組分的抑制率及半數(shù)抑制濃度的測定

將篩選出對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用最明顯的GBRG組分溶解，配成1.00，0.50，0.20，0.10，0.05，0.01mg/mL備用，按照1.3.2.1節(jié)所述方法，求出50%抑制率對應的α-葡萄糖苷酶抑制劑的濃度，即為GBRG組分的半數(shù)抑制濃度（IC50）。α-葡萄糖苷酶抑制率計算公式為（1）。

式中：a—無樣品α-葡萄糖苷酶溶液的吸光值；b—無樣品也無α-葡萄糖苷酶的吸光值；c—有樣品的α-葡萄糖苷酶混合溶液的吸光值；d—無α-葡萄糖苷酶樣品的吸光值。

1.3.3.3 各組分GBRG對α-淀粉酶抑制活性的測定

用α-淀粉酶（2U/mL）溶液0.2mL各組分GBRG溶液（1mg/mL）在37℃預混合10min，以0.3mL5%的淀粉溶液為底物，孵育15min。加入2mLDNS試劑，100℃加熱15min，測定其在540nm處的吸光度。試驗重復3次，取平均值。

1.3.3.4 具有α-淀粉酶抑制作用的GBRG組分

對α-淀粉酶的抑制率及半數(shù)抑制濃度的測定選擇對α-淀粉酶具有最明顯抑制作用的GBRG組分配成0，0.2，0.4，0.6，0.8，1mg/mL溶液備用，按照1.3.2.3節(jié)所述方法，求出50%抑制率對應的α-淀粉酶抑制劑的濃度，即為GBRG組分的半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）。α-淀粉酶的抑制活性計算公式為（2）。

式中：Ac—不加樣品的α-淀粉酶溶液吸光度；A'c—不含樣品和α-淀粉酶的吸光度；As—含樣品但不含α-淀粉酶的吸光度；A's—無α-淀粉酶的樣品溶液吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 GBRG的抗炎作用研究結(jié)果分析

2.1. 1不同GBRG組分對細胞增殖影響結(jié)果

MTT法測定不同濃度WEG、SEG-1和SEG-2糖蛋白組分對RAW264.7存活率的影響結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，糖蛋白在低濃度時，對經(jīng)LPS誘導后的RAW264.7細胞生長并無抑制效果，細胞的存活率較高；在中濃度時，抑制的作用稍顯提高，細胞的存活率下降，但基本高于對照組；高濃度時，抑制作用減弱，細胞存活率有所提升。結(jié)果表明：當糖蛋白溶液質(zhì)量濃度在0.025～0.2mg/mL時，對RAW264.7細胞沒有毒性且細胞存活率高于對照組

2.1.2 RT-PCR測定細胞因子TNF-α、COX-2、IL-1β和iNOS的表達結(jié)果

2.1.2.1 糖蛋白WEG對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子表達的影響

糖蛋白WEG對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子表達如圖2所示。

由圖2可知，與空白組相比，經(jīng)1μg/mL的LPS誘導1d后，可以增加小鼠巨噬細胞RAW264.7iNOS、COX-2、TNF-α與IL-1βmRNA的相對表達水平（P＜0.01），其值分別為1.03，0.873，0.891與0.911。WEG和誘導后的RAW264.7細胞一起培養(yǎng)1d后，和LPS的對照組相比，低劑量組均可以調(diào)節(jié)iNOS、COX-2及IL-1βmRNA的相對表達水平，而中、高劑量組iNOS、COX-2和IL-1βmRNA的相對表達水平顯著下降（P＜0.05），降至最低值各為0.571，0.549，0.544；對于炎癥因子TNF-α，低、中、高劑量都可降低mRNA的相對表達水平，從0.648降至0.247，且呈劑量依賴關(guān)系。

2.1.2.2 糖蛋白SEG-1對LPS誘導得RAW264.7細胞炎癥因子表達的影響

糖蛋白SEG-1對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子表達如圖3所示。

由圖3可知，與空白組相比，經(jīng)1μg/mL的LPS誘導1d后，炎癥因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1βmRNA的相對表達水平極顯著上升（P＜0.01），分別達到1.341，1.387，0.871和0.915。低劑量的SEG-1對iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1βmRNA的相對表達水平有顯著的降低作用（P＜0.05），分別降至0.967，1.053，0.72和0.693。中、高劑量的SEG-1對于IL-1β、TNF-α、COX-2和iN-OSmRNA的相對表達水平有極顯著的作用（P＜0.01），尤其是在對TNF-α炎癥因子上。各表達水平最低降至0.574，0.587，0.221和0.492。

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