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          發(fā)芽糙米糖蛋白抗炎、降血糖性能分析(一)

          發(fā)布時間:2021-11-18 20:12 編輯者:特邀作者周世紅

          糖蛋白是廣泛存在于植物、動物和微生物機體內(nèi)必不可少的生物大分子,一般由多肽鏈和低聚糖鏈共價結合而成。糖鏈影響多肽鏈或蛋白質(zhì)的折疊形態(tài)和整體構象。糖鏈與多肽鏈或蛋白質(zhì)連接的特殊結構使糖蛋白有多種存在形式,從而具有多種生物活性。糖蛋白具有預防腫瘤,抗氧化,降膽固醇,提高機體免疫力等作用。糙米發(fā)芽過程的實質(zhì)是糙米活化。發(fā)芽使糙米內(nèi)部的多種酶被激發(fā)并且釋放,從結合狀態(tài)轉(zhuǎn)化為游離狀態(tài),釋放出更多的營養(yǎng)物質(zhì)。發(fā)芽后的糙米不僅含原有的肌醇六磷酸鹽、膳食纖維、多種抗氧化物質(zhì)以及游離態(tài)微量元素和多種維生素,還含有新生成的營養(yǎng)物質(zhì)如γ-氨基丁酸等。其中蘊含的營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)顯著提高,食用和保健功能大幅度增加。有研究表明,糙米發(fā)芽后,其糖蛋白性能也有所改變,糖蛋白含量隨著萌發(fā)時間的延長而增加,且抗氧化性與萌發(fā)時間呈正相關。目前國內(nèi)外對GBRG的相關研究鮮有報道。

          本試驗采取超聲輔助提取GBRG,用DEAECellulose52陰離子交換層析法、SephadexG-200凝膠層析法分離純化,對純化的GBRG進行抗炎和降血糖性能分析。為進一步探尋消除炎癥,改善胰島素抵抗的天然藥物功能性食品提供基礎數(shù)據(jù)。

          1 材料與方法

          1.1 材料與試劑

          1.1.1 發(fā)芽糙米粗糖蛋白樣品制備

          供試粳稻為“龍粳”,用龔谷機去除稻子外殼得到糙米,按照文獻將糙米發(fā)芽并制備發(fā)芽糙米粗糖蛋白樣品,凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

          1.1.2 試劑

          DEAE-Cellulose52,日本Pharmacia集團;脂多糖,北京索萊寶有限公司;硫酸、磷酸、乙酸、氯化鐵、碘化鉀、苯酚、硫酸銅、鄰二氮菲、鐵氰化鉀、鹽酸羥胺、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、吡啶、乙酸酐、鹽酸(分析純)等,南京生物化學試劑研究中心;α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖,上海和氏璧化工有限公司。

          1.2 儀器與設備

          680型酶標儀,日本Bio-Rad集團;CKX41型倒置顯微鏡,日本Olympus公司;Bj5060UV型CO2培養(yǎng)箱,美國Heraeus研究中心;DL-CJ-IN型超凈工作臺,南京醫(yī)療儀器制造中心;T25細胞培養(yǎng)瓶、24孔細胞培養(yǎng)板、96孔細胞培養(yǎng)板,德國Corning公司。

          1.3 方法

          1.3.1 發(fā)芽糙米粗糖蛋白的分離純化

          分離純化流程GBRG粗品→上DEAE-Cellulose52陰離子柱→蒸餾水洗柱→氯化鈉洗柱→繪制梯度洗脫曲線→洗脫峰透析、除鹽、濃縮、凍干→溶于蒸餾水→上SephadexG200瓊脂糖凝膠柱→氯化鈉洗柱→確定梯度洗脫曲線→洗脫峰透析、濃縮、凍干備用。

          每一步獲得的GBRG均使用考馬斯亮藍法、苯酚-硫酸法檢測其多糖及蛋白質(zhì)含量。GBRG經(jīng)DEAE-Cellulose52陰離子交換層析和SephadexG200瓊脂糖凝膠柱層析,得到3個糖蛋白組分峰,分別命名為WEG、SEG-1和SEG-2。采用高效液相色譜、紅外光譜、圓二色性、1H-NMR譜等方法進行結構分析,證明3個GBRG組分峰具有顯著的糖蛋白特征。

          1.3.2 GBRG的抗炎作用研究

          1.3.2.1 細胞模型的建立

          參照Xie等、Kim等的試驗方法并加以調(diào)整,經(jīng)100ng/mLLPS誘導RAW264.7細胞,建立細胞炎癥模型。

          1.3.2.2 MTT法測定細胞增殖活性

          選用96孔培養(yǎng)板,分為3組:空白、對照、樣品,3孔/組。將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞配成濃度1×105個/mL的細胞懸液,各孔添加100μL,進行培育,過夜待用。各組分GBRG溶于細胞培養(yǎng)液,終濃度為濾膜微孔過濾,混入100μL濃度不一的含GBRG的培養(yǎng)液,再把培養(yǎng)板放于37℃、CO2體積分數(shù)5%的培養(yǎng)箱中,連續(xù)孵育24h,混入200μL5mg/mLMTT溶液/孔,培育4h。使用1mL注射器收集各孔中的上清液,與100μLDM-SO混合,振動搖勻8min使結晶物全部溶解,570nm檢測細胞相對活力。

          細胞相對活性=(樣品組-空白組)/(對照組空白組)×100%

          1.3.2.3 RT-PCR測定細胞因子TNF-α、COX-2、IL-1β和iNOS的表達

          (1)細胞分組

          將RAW264.7細胞接于96孔板(5×105個/mL),劃分成4組,培育過夜,各組包括3個重復孔。正常組:未加入LPS;LPS組:LPS質(zhì)量濃度是1μg/mL;WEG糖蛋白組(50,100,200μg/mL)+1μg/mLLPS;SEG-1糖蛋白組(50,100,200μg/mL)+1μg/mLLPS;SEG-2糖蛋白組(50,100,200μg/mL)+1μg/mLLPS。先向細胞中添加各濃度糖蛋白,1h后加入LPS孵化24h。

          (2)引物設計

          按照IL-1β、β-actin、COX-2、iNOS與TNF-α的基因序列,由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成。具體內(nèi)容如表1所示:

          (3)RNA提取

          選擇總RNA試劑盒用以提取RAW264.7細胞的總RNA,測定RNA濃度。

          (4)逆轉(zhuǎn)錄反應

          逆轉(zhuǎn)錄反應的試劑為50ng~5μg總RNA、1μL引物Oligo(dT)18(0.5μg/μL)、10μL2×ES反應液、1μLRT/RI逆轉(zhuǎn)錄酶、1μLgDNA。將RNA模板、引物和DEPC水混合,65℃孵育5min后,冰浴2min,加入引物Oligo(dT)18,用于逆轉(zhuǎn)錄試驗。42℃孵育15min,最后85℃孵育,使RT/RI與gDNA酶進行逆轉(zhuǎn)錄反應。

          (5)PCR擴增

          對逆轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA進行PCR。在PCR管中加入SYBRGreen染料5μL、上游引物0.3μL、下游引物0.3μL、待測cD-NA5μL、DEPC水2.4μL。低速離心30s,使管內(nèi)溶液完全混合,然后用RealtimePCR儀進行PCR擴增。反應條件為:94℃,5min預變性;65℃、2min,94℃、2min,共30個循環(huán)。

          聲明:本文所用圖片、文字來源《中國食品學報》,版權歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權等問題,請與本網(wǎng)聯(lián)系

          相關鏈接:鄰苯三酚鄰二氮菲,阿卡波糖乙酸酐

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