酵母β-葡聚糖是存在于酵母細(xì)胞壁中的一種多糖，占細(xì)胞壁干質(zhì)量的40％～60％。酵母β-葡聚糖是以β-1，3一葡聚糖為主，β-1，6一葡聚糖為輔的一種混合多糖，其中85％左右為水不溶性。研究表明，酵母β-葡聚糖是一種良好的生物效應(yīng)應(yīng)答劑，具有增強(qiáng)免疫力、激活免疫細(xì)胞、抗腫瘤、抗感染等功能。此外，酵母β-葡聚糖還可以抗氧化、抗輻射、降低膽固醇和血脂。因此。酵母β-葡聚糖已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健食品和化妝品行業(yè)中。

酵母β-葡聚糖通過(guò)分子間氫鍵的相互作用，形成致密的三股螺旋結(jié)構(gòu)而不溶于水，水不溶性不僅制約了酵母β-葡聚糖的應(yīng)用范圍，也會(huì)影響其生物活性的發(fā)揮。為了提高酵母β-葡聚糖的水溶性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了修飾和改性研究。主要方法有化學(xué)方法、物理方法和生物方法。物理方法主要有超聲波法門、輻照法和機(jī)械活化法；化學(xué)方法有羧甲基化、硫酸酯化和磷酸酯化；生物方法主要是酶法。酶法增溶改性是通過(guò)β-葡聚糖酶將大分子酵母β-葡聚糖酶解成小分子葡聚糖，從而增加酵母β-葡聚糖的水溶性，水解過(guò)程條件溫和，不會(huì)破壞酵母β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)，對(duì)其生物活性影響較小。目前，用于生物法對(duì)酵母葡聚糖改性增溶的酶種類少，價(jià)格昂貴。本研究中，作者在大腸桿菌中異源表達(dá)兩種不同的酵母β-葡聚糖水解酶，分別是β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m和β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312。Gly5m來(lái)源于Saccharophagusdegradans2-40T，對(duì)于β-1，3-葡聚糖具有內(nèi)切水解作用。BT3312來(lái)源于Bacteroidesthetaiotaomicron，對(duì)β-1，6-葡聚糖具有內(nèi)切水解作用。通過(guò)兩種不同的酵母β-葡聚糖的水解作用，可以降低酵母β-葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量，增加其在水中的溶解率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

E.coli(大腸桿菌)JM109：用于構(gòu)建和增殖重組質(zhì)粒，作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；E.coli(大腸桿菌)BL21：表達(dá)宿主，作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pET-28a(+)(Kan+，T7啟動(dòng)子)：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 酶、引物、DNAmarke及相關(guān)試劑盒

PrimerSTARDNA聚合酶、DNAmarker、T4DNA連接酶和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備盒：均購(gòu)自TaKaRa(大連)；各種限制性內(nèi)切酶：購(gòu)自Thermo公司：PCR引物：由生工生物(上海)有限公司合成，見表1；質(zhì)粒小量抽提試劑盒：購(gòu)自生工生物(上海)有限公司：酵母葡聚糖：購(gòu)自安琪酵母公司。

1.1.3培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(組分g/L)：蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5；自然pH。制備固體培養(yǎng)基時(shí)添加2g/dL的瓊脂。

TB培養(yǎng)基(組分g/L)：蛋白胨12，酵母提取物24，KH₂P0₄2.31，K₂HP0₄12.54；甘油4mL。

1.2 方法

1.2.1 目的基因獲得

1)gly5m的獲得：根據(jù)GenBank噬菌體的gly5m基因(基因收錄號(hào)：ABD82280.1)由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行全基因合成。

2)bt3312的獲得：根據(jù)GenBank多形擬桿菌的bt3312基因(基因收錄號(hào)：AE015928.1)由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行全基因合成。

1.2.2 重組載體的構(gòu)連

1)pET-28a(+)-gly5m的構(gòu)建：設(shè)計(jì)引物Fl和R1，以合成的gly5m為模板PCR擴(kuò)增得到上游帶有BamHI酶切位點(diǎn)和下游帶有Xho酶切位點(diǎn)的gly5m產(chǎn)物。用BomHI和XhoI對(duì)PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28a(+)進(jìn)行酶切后，用T4DNA連接酶進(jìn)行過(guò)夜連接,轉(zhuǎn)化E.ColiJMl09感受態(tài),挑取轉(zhuǎn)化子測(cè)序，測(cè)序正確即獲得重組質(zhì)粒pET-28a(+)-gly5m，見圖1。

2)pET-28a(+)-bt3312的構(gòu)建：設(shè)計(jì)引物F2和R2，以合成的bt3312為模板PCR擴(kuò)增得到上游帶有BanHI酶切位點(diǎn)和下游帶有XhoI酶切位點(diǎn)的bt3312產(chǎn)物。用BamHI和XhoI對(duì)PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28a(+)進(jìn)行酶切后，用T4DNA連接酶進(jìn)行過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化E.coliJMl09感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子測(cè)序，測(cè)序正確即獲得重組質(zhì)粒pET-28a(+)-bt3312。

1.2.3 重組載體的轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)表達(dá)

挑取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.ColiBL21(DE3)。挑取單菌落接種于裝有3mLLB液體培養(yǎng)基(含有50μg/mL氨芐青霉素或卡那霉素)的12mL搖菌管中，37℃、220r/min過(guò)夜培養(yǎng)。種子液按2％接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至含50mLTB(含有50μg/mL氨芐青霉素或卡那霉素)的250mL三角瓶中，37℃、220r/min培養(yǎng)至OD60=0.6～0.8，添加終濃度為0.2mmol/L的IPTC誘導(dǎo)，誘導(dǎo)表達(dá)12h，收集菌體。

1.2.4 重組β-葡聚糖水解酶的酶活測(cè)定

發(fā)酵液于7000r/min離心10min，分離得到上清液即胞外粗酶液。收集菌體，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9％的生理鹽水洗滌，20mm01/LPBS緩沖液(pH7.5)重懸菌體，稀釋至合適的濃度，超聲破碎。13000r/min離心30min，分離得到破碎上清液，即胞內(nèi)粗酶液。底物配制：20mmol/LPBS緩沖液(pH7.5)，10mg/mL的酵母葡聚糖。990μL底物加10μL適當(dāng)稀釋的粗酶液于37℃水浴保溫30min，DNS法測(cè)還原糖質(zhì)量濃度。

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