草石蠶又名螺絲菜、甘露子，是一種唇形科水蘇屬多年生草本植物。原產(chǎn)地是中國，主要分布于云南、四川、貴州、西北和華北等地。草石蠶營養(yǎng)價值豐富，富含蛋白質(zhì)、多糖、多種礦物質(zhì)和維生素，口感脆爽鮮嫩且無纖維，是腌制泡菜的上好食材。傳統(tǒng)的草石蠶腌制工藝是利用附著在草石蠶菜體上的乳酸菌等微生物，配合糖、醋等輔料進行自然發(fā)酵，這種腌制工藝雖然便捷，但是在腌制過程中會產(chǎn)生大量的亞硝酸鹽或滋生大量雜菌，導(dǎo)致產(chǎn)品亞硝酸鹽含量過高、霉變、腐敗，威脅人體健康。

乳酸菌通常被認為是食品級微生物，由于能產(chǎn)生獨特的風(fēng)味和具有抗菌作用而廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品中，其中利用乳酸菌制作泡菜類食品最為常見。研究表明，乳酸菌在發(fā)酵過程中能有效降解亞硝酸鹽，抑制泡菜中雜菌生長；同時，乳酸菌發(fā)酵還能產(chǎn)生維生素、多糖等營養(yǎng)成分，提高泡菜產(chǎn)品的營養(yǎng)附加值。吳映明等研究發(fā)現(xiàn)人工接種乳酸菌腌制甘藍泡菜，能有效降低甘藍泡菜的亞硝酸鹽水平。吳海清等采用直投式乳酸菌粉腌制衛(wèi)青蘿卜泡菜能縮短發(fā)酵周期。目前，國內(nèi)外利用乳酸菌發(fā)酵草石蠶泡菜的研究鮮有報道。

本研究旨在篩選優(yōu)質(zhì)益生乳酸菌，并將其接種至草石蠶菜汁培養(yǎng)基發(fā)酵，模擬人工接種乳酸菌發(fā)酵草石蠶腌制泡菜。通過分析其發(fā)酵草石蠶菜汁時的生長特性、產(chǎn)酸特性、抑菌特性、B族維生素含量等指標，探究乳酸菌對草石蠶泡菜的影響。

1 材料與設(shè)備

1.1 菌種來源

本研究所用到的菌株如表1所示。

1.2 主要試劑和藥品

亞硝酸鈉、亞鐵氰化鉀、四硼酸鈉、乙酸鋅、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、瓊脂粉、氯化鈉、硫酸錳、牛肉浸膏、七水硫酸鎂、檸檬酸二氫鉀、吐溫-80、無水乙酸鈉、磷酸氫二鉀、無水葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉購于永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基和緩沖液

1)MRS液體培養(yǎng)基

蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、無水葡萄糖20g/L、牛肉膏10g/L、磷酸氫二鉀2g/L、檸檬酸氫二銨2g/L、乙酸鈉5g/L、七水硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.05g/L、吐溫801mL/L，121℃滅菌15min。固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2％的瓊脂。

2)葉酸測定培養(yǎng)基(FACM)

FACM干粉配置成96.9g，L的溶液，121℃滅菌15min。

3)LB半固培養(yǎng)基

胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L、瓊脂粉1.2％，調(diào)節(jié)pH值至7.0，121℃滅菌15min。

4)葉酸緩沖液

磷酸二氫鉀0.1mol/L、磷酸氫二鉀0.1mol/L、抗壞血酸0.1g/L，調(diào)節(jié)pH值至6.8，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 儀器和設(shè)備

pH酸度計(PB-10)、電子天平(PL203)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；渦旋振蕩器(SW-2FD)，上海醫(yī)科大學(xué)科學(xué)儀器廠；生物安全柜、小型離心機，美國Thermo公司；生化培養(yǎng)箱(SPX-150B-Z型)，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；尤尼柯2000可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；全自動滅菌鍋，美國Tuttnauer公司；恒溫水浴鍋(DK-8D)，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；冷凍干燥機，德國Christ公司；酶標儀(SpectraMax190)，美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.5 試驗方法

1.5.1 草石蠶菜汁培養(yǎng)基的制備

將新鮮草石蠶洗凈后清水浸泡2h，按料液比1:1的比例加水榨汁。菜汁用雙層紗布過濾2次后離心20min(4℃，10000r/min)。取上清液加入2％的葡萄糖和2％氯化鈉，121℃滅菌15min后備用。

1.5.2 益生乳酸菌的篩選

1.5.2.1 菌株的活化

菌種活化：將-80℃保藏的菌種用劃線的方法活化。將乳酸菌、指示菌劃線于適宜的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(見表1)。挑取單菌落于相應(yīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。

1.5.2.2 優(yōu)勢菌的篩選

選自實驗室菌種保藏庫中的10株乳酸菌經(jīng)活化后，按3％的接種量接至草石蠶菜汁培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后用紫外-分光光度計測定菌液0D_600nm值。按0D_600nm值的大小選取生長情況良好的菌株進行后續(xù)試驗。

1.5.2.3 接種量的確定

定將初篩獲得的植物乳桿菌ZJ316、副干酪乳桿菌ZFM54、沙克乳桿菌ZFM225經(jīng)活化后，按1％，2％，3％，4％，5％的接種量接至草石蠶菜汁培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，利用平板涂布法測定草石蠶菜汁發(fā)酵液中的活菌數(shù)。

1.5.2.4 菌株生長曲線和產(chǎn)酸量的測定

將植物乳桿菌ZJ316、副干酪乳桿菌ZFM54、沙克乳桿菌ZFM225活化后。按3％的接種量接入草石蠶培養(yǎng)基，每隔4h用紫外-分光光度計測定菌液的OD_600nm值、pH值和可滴定酸濃度。用0.05mol/L的NaOH溶液進行酸堿滴定，并以酚酞溶液為指示劑指示滴定終點，可滴定酸度按式(1)計算：

式中，α一總酸度，％；N_NAOH一NaOH溶液的濃度，mol/L；V_NAOH一NaOH溶液滴定體積，mL；V_樣品—樣品體積，mL。

1.5.2.5 亞硝酸鹽降解試驗

將活化的植物干桿菌ZJ316、副干酪乳桿菌ZFM54、沙克乳桿菌ZFM225按3％的接種量接至含1％NaNO2的草石蠶菜汁培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，每6h取樣。參照國標GB5009.33-2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法繪制標準曲線，并測定亞硝酸鹽含量，計算結(jié)果用降解率表示。

降解率(％)=[1-(樣品亞硝酸鹽含量/空白組亞硝酸鹽含量)]×100（2）

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